[發明專利]一種基于表面等離子共振技術的種質資源中特定DNA序列鑒定方法

有效

• 申請號: 201210110730.8
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102661932A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 王利兵;于艷軍;蘇榮欣
• 申請（專利權）人: 王利兵
• 主分類號: G01N21/55
• 分類號: G01N21/55
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種應用表面等離子體共振儀的種質資源中特定DNA序列鑒定方法，利用同一傳感芯片對特定種質資源或DNA序列進行鑒定；其特征在于包括以下步驟：

（一）傳感芯片表面適配體固定：選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50μL濃度為1-50μg/L已標記生物素的免疫球蛋白E適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上免疫球蛋白E適配體；

（二）對特定單鏈DNA進行免疫球蛋白E標記；

（三）標準溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸鹽緩沖液配置免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液，濃度為0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定單鏈DNA相應的適配體或納米粒子修飾的適配體充分混合，獲得特定單鏈DNA標準溶液，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還可以大于加入的適配體量；

（四）建立對照曲線：采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100μL特定單鏈DNA標準溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，獲得特定單鏈DNA表面溶液的表面等離子體共振譜圖穩定值A；

（五）檢測鑒定：提取種質資源總DNA，進行不對稱PCR擴增反應，獲得單鏈DNA；對于待測單鏈DNA樣品進行一系列預處理，取待測單鏈DNA溶液與免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液充分混合后，競爭結合特定單鏈DNA相應的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還不少于加入的適配體量；采用表面等離子體共振檢測儀記錄待測單鏈DNA的光譜圖；通過檢測免疫球蛋白E，間接鑒定特定DNA是否存在；對比待測單鏈DNA樣品的譜圖穩定值B與特定單鏈DNA的譜圖穩定值A，當B小于A時，說明種質資源中含有特定DNA序列，當B等于A時，說明不含有特定DNA序列；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH為2-3）的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進行傳感元件再生，用于其它種質資源中特定DNA序列的鑒定。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（二）的標記方法包括DNA的對苯二異硫氰酸酯修飾和與免疫球蛋白E的氨基偶聯。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：當種質資源為水稻，標記方法為將水稻一段SSR單鏈與對苯二異硫氰酸酯反應后，再與免疫球蛋白E的氨基偶聯，形成通過對苯二異硫氰酸酯連接的免疫球蛋白E-SSR序列偶聯物，待用。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用核酸適配體為識別分子，核酸適配體序列與待測物直接相關。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（一）傳感器表面適配體固定，包括如下步驟：

（1）將鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片插入表面等離子體共振檢測儀中，在工作通道中進行在線傳感表面修飾；

（2）通入0.02mol/L（pH＝7.4）的磷酸鹽緩沖液；

（3）通入5-50μL濃度為1-50μg/L生物素修飾的免疫球蛋白E適配體溶液，進行在線偶聯至基線穩定；

（4）重復步驟（2）至（3），獲得免疫球蛋白E適配體修飾的傳感芯片。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用免疫球蛋白E標記待測物，與未標記樣品一起與核酸適配體發生特異性競爭識別。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（三）中納米粒子可以是金屬納米粒子或磁性納米粒子或高分子化合物。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（四）和（五）中通過檢測免疫球蛋白E的含量，間接鑒定特定DNA是否存在，提高表面等離子體傳感芯片的可重復利用性，適用于各種種質資源中特定DNA序列的檢測。