[發明專利]一種基于表面等離子共振技術的種質資源中特定DNA序列鑒定方法

有效

• 申請號: 201210110730.8
• 申請日: 2012-04-17
• 公開（公告）號: CN102661932A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 王利兵;于艷軍;蘇榮欣
• 申請（專利權）人: 王利兵
• 主分類號: G01N21/55
• 分類號: G01N21/55
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種種質資源中特定DNA序列鑒定技術，特別是基于表面等離子共振技術，核酸適配體與未標記和標記的樣品特異性競爭識別，采用免疫球蛋白E修飾的傳感元件間接鑒定種質資源中特定DNA序列的方法。

背景技術

種質資源是國民經濟可持續發展的基礎性戰略資源。然而，近年來，我國種質資源流失嚴重，一方面我國擁有的人類遺傳資源、重要經濟作物資源、藥用資源、工業微生物資源等通過非正當途徑大量流失到國外；另一方面一些發達國家在我國建立植物提取物粗加工基地，掠奪性地從我國引進優等藥材和資源性提取物。此外，長期以來，我國種質資源鑒定通常是根據形態標記來進行的，如株高、穗長、粒色等。此種形態標記簡單直觀，但存在數少、多態性差、易受環境條件影響等缺點。因此，導致我國種質資源保護工作面臨著巨大的挑戰，嚴重缺乏能滿足巨大數量和多種類型物種資源檢測鑒定的分析技術。

近10年來，在人類基因組研究計劃的推動下，結合現代檢測鑒定技術，分子標記的研究與應用得到了迅速的發展。熒光定量PCR技術可以通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，但該技術目前并不能準確地鑒定種質資源；而建立在PCR基礎上直接測序的方法，成本昂貴，無法實現快速高通量檢測鑒定。可以說，在物種遺傳標記等真實性檢測鑒定技術方面我國基本處于空白狀態。以表面等離子體共振譜儀為技術平臺，可以為種質資源中特定DNA序列的快速鑒定提供一種簡便可靠的方法，大大縮短了檢測鑒定時間，有望發展成為種質資源鑒定的標準化檢測平臺。但其存在傳感芯片檢測專一性和成本高問題。例如，采用表面等離子體共振原理檢測的儀器BIACore，其常用傳感器芯片SA芯片成本為3000多元人民幣。因此，如何實現同一傳感芯片檢測不同特定DNA序列已成為表面等離子體共振檢測領域熱點研究問題。

發明內容

為了解決現有特定DNA序列分析技術存在的耗材量大、造價昂貴等問題，同時滿足對種質資源中各種DNA序列的鑒定要求，本發明提供了一種種質資源中特定DNA的表面等離子體共振鑒定方法。該方法具有通用、高穩定性、高靈敏度、操作簡單等優點，滿足對種質資源中特定DNA序列的鑒定要求。

本發明的技術方案為：一種應用表面等離子共振儀的種質資源中特定DNA序列鑒定方法，利用同一傳感芯片對不同種質資源中特定DNA序列進行鑒定；其特征在于包括以下步驟：

（一）傳感芯片表面適配體固定：選擇鏈霉親和素SA修飾的傳感芯片，通過通入5-50μL濃度為1-50μg/L已標記生物素的免疫球蛋白E適配體，在表面等離子體傳感芯片上固定上免疫球蛋白E適配體；

（二）對特定單鏈DNA進行免疫球蛋白E標記，標記方法根據待測物基團不同；所述標記方法包括DNA的對苯二異硫氰酸酯修飾和與免疫球蛋白E的氨基偶聯。如將水稻一段SSR單鏈與對苯二異硫氰酸酯反應后，再與免疫球蛋白E的氨基偶聯，形成通過對苯二異硫氰酸酯連接的免疫球蛋白E-SSR序列偶聯物，待用；

（三）標準溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸鹽緩沖液配置免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液，濃度為0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定單鏈DNA相應的適配體或納米粒子修飾的適配體充分混合，獲得特定單鏈DNA標準溶液，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還可以大于加入的適配體量；

（四）建立對照曲線：采用表面等離子共振譜儀測量，以0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液為測量基準，通過微泵通入5-100μL特定單鏈DNA標準溶液，記錄下表面等離子體共振儀光譜圖，獲得特定單鏈DNA表面溶液的表面等離子體共振譜圖穩定值A；

（五）檢測鑒定：提取種質資源總DNA，進行不對稱PCR擴增反應，獲得單鏈DNA；對于待測單鏈DNA樣品進行一系列預處理，取待測單鏈DNA溶液與免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA溶液充分混合后，競爭結合特定單鏈DNA相應的適配體或納米粒子修飾的適配體，其中免疫球蛋白E標記的特定單鏈DNA量還不少于加入的適配體量；采用表面等離子體共振檢測儀記錄待測單鏈DNA的光譜圖；通過檢測免疫球蛋白E，間接鑒定特定DNA是否存在；對比待測單鏈DNA樣品的譜圖穩定值B與特定單鏈DNA的譜圖穩定值A，當B小于A時，說明種質資源中含有特定DNA序列，當B等于A時，說明不含有特定DNA序列；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH為2-3）的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，沖洗傳感芯片表面，進行傳感元件再生，用于其它種質資源中特定DNA序列的鑒定。