[發明專利]一種組織工程化軟骨移植物的制備方法及產品

無效

• 申請號: 201210110340.0
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN103372233A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 孫冬梅;楊丹;吳明皇;柴勛
• 申請（專利權）人: 杭州龍禧生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: A61L27/48
• 分類號: A61L27/48;A61L27/38
• 代理公司: 杭州新源專利事務所(普通合伙) 33234
• 代理人: 李大剛

1.一種組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于：采用冷凍-凍干法將PLGA絲線編織網，整合-到膠原-殼聚糖支架中，形成PLGA編織網/膠原-殼聚糖復合支架；將濃度大于1x10⁷個/ml的軟骨細胞添加到纖維蛋白凝膠中并充分混勻細胞，將細胞-纖維蛋白混合液接種于上述支架中，形成組織工程移植物。

2.如權利要求1所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于：先用編織機將PLGA絲線編織成網，用丙酮清洗1-3次，去離子水清洗2-5次，每次10-50min；然后在真空30-60℃下干燥20-50h，80-120℃下撐幅定型30-45h，得到厚度為0.5-1.0mm，相對孔徑為250-350μm的PLGA編織網；將上述PLGA編織網裁剪成邊長為2-5cm的正方形并置于模具中，注入膠原-殼聚糖混合溶液0.5-3ml/m²，經過零下90-120℃冷凍-凍干處理10-36h，待溶劑完全升華后即獲得厚度為0.1-0.3cm的PLGA編織網/膠原-殼聚糖復合支架；將濃度＞1x10⁷個/ml的軟骨細胞經0.1-0.4％胰酶消化離心，用20-30mmol/L的氯化鈣溶液重懸混勻成單細胞懸液；將凝血酶溶于上述含軟骨細胞的氯化鈣溶液中，使氯化鈣溶液中含凝血酶的濃度為60-120U/ml，得溶液A；將纖維蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纖維蛋白的濃度為50-100mg/ml，得溶液B；使用一次性醫用雙聯注射器分別吸取等量的溶液A和B，緩慢同時輕推兩側，將混合后的纖維蛋白膠均勻的涂抹在支架上，形成組織工程化軟骨移植物，將上述組織工程化軟骨移植物置于培養皿中于37℃、5％二氧化碳培養箱培養50-90h，進行雙層無菌包裝，儲存于1-8℃專業醫用冷鏈內，即得。

3.如權利要求2所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于：先用編織機將PLGA絲線編織成網，用丙酮清洗1次，去離子水清洗3次，每次15min；然后在真空45℃下干燥36h，105℃下撐幅定型36h，得到厚度為0.8mm，相對孔徑為300μm的PLGA編織網；將上述PLGA編織網裁剪成邊長為4cm的正方形并置于模具中，注入膠原-殼聚糖混合溶液1ml/m²，經過零下105℃冷凍-凍干處理20-30h，待溶劑完全升華后即獲得厚度為0.2cm的PLGA編織網/膠原-殼聚糖復合支架；將濃度＞1x10⁷個/ml的軟骨細胞經0.25％胰酶消化離心，用40mmol/L氯化鈣溶液重懸混勻成單細胞懸液；將凝血酶溶于上述含軟骨細胞的氯化鈣溶液中，使氯化鈣溶液中含凝血酶的濃度為80-100U/ml，得溶液A；將纖維蛋白原粉末溶解于PBS溶液中，使PBS溶液中含纖維蛋白的濃度為60-80mg/ml，得溶液B；使用一次性醫用雙聯注射器分別吸取等量的溶液A和B，緩慢同時輕推兩側，將混合后的纖維蛋白膠均勻的涂抹在支架上，形成組織工程化軟骨移植物，將上述組織工程化軟骨移植物置于培養皿中于37℃、5％二氧化碳培養箱培養72h，進行雙層無菌包裝，儲存于4℃專業醫用冷鏈內，即得。

4.如權利要求2或3所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于：所述的膠原-殼聚糖混合溶液以體積比計算，為I型膠原蛋白液∶20g/L殼聚糖＝6-9∶4-1。

5.如權利要求4所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于：所述的膠原-殼聚糖混合溶液以體積比計算，為I型膠原蛋白液∶20g/L殼聚糖＝9∶1。

6.如權利要求1至3中任一項所述的組織工程化軟骨移植物的制備方法，其特征在于：所述濃度＞1x10⁷個/ml的軟骨細胞的是這樣制備的：關節鏡下采集患者自體關節軟骨180mg，潔凈室安全柜內進行軟骨細胞分離操作，軟骨放入無菌緩沖液中切割至＜1mmx1mm大小，加入0.01-0.1％混合膠原酶，30-45度振蕩消化5-15h后，過濾除去未消化的軟骨組織塊，過濾液1000-1500rpm離心5-15min，沉淀用細胞級PBS洗1-3次，加入DMEM/F12培養液混勻后按細胞濃度2x10⁴-2x10⁶個/ml接種到T75FLASK內，37℃，5％二氧化碳培養箱內培養，每隔1-3天換DMEM/F12培養液1次，培養代次不超過P2。