[發明專利]檢測維生素C生產菌株傳代培養過程中營養環境變化的方法

無效

• 申請號: 201210109628.6
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN102634562A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 元英進;高赟;鄒旸;胡夢龍;任恒千
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N30/02;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于工業微生物領域，涉及一種檢測維生素C生產菌株傳代過程中營養環境變化的方法。

背景技術

目前，我國生產維生素C的方法為“二步發酵法”，第一步發酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉化為L-山梨糖，第二步發酵為巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌混合發酵，將山梨糖轉化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。其中，第二步發酵中前者為伴生菌，后者為產酸菌。兩菌在混合發酵的過程中，通過相互作用促進產酸菌的生長和產酸。通過混菌傳代培養，混菌發酵生產2-酮基-L-古龍酸的能力得到提高，但其作用機理尚不明確。

隨著高通量的現代儀器分析技術和化學計量學方法的發展，過程分析技術(PAT)可以有效地應用于生物發酵過程中營養環境變化的研究。在兩菌長期的混合培養中，它們之間的交流使得培養液的營養環境不斷的發生變化，進而傳遞到胞內，產生一系列不同的生長及發酵行為。

如果采用PAT技術研究兩菌傳代培養，特別是在不斷強化相互作用的過程中，檢測出培養基中營養環境的變化情況，將為揭示傳代培養強化兩菌相互作用促進產酸的作用機制提供有利信息，并為進一步優化生產工藝等提供支持。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種檢測維生素C生產菌株傳代過程中營養環境變化的方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種檢測維生素C生產菌株傳代過程中營養環境變化的方法，包括如下步驟：

(1)混菌傳代培養：

①固體培養：

取存于液氮的10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)和10-500μL保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養基上，28-35℃，培養24-48h；

②種子培養：

將經步驟(1)①培養的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩混菌培養，以24-48h為傳代周期，以體積比為1％-10％為傳代比接入新的種子培養基中，傳代100-150天得到混菌細胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3-4個時間取樣，取3-4個樣；

③分純：

將步驟(1)②獲得的3-4個樣的混菌細胞劃線分純后再分別接種于固體培養基上，28-35℃培養24-48h；再分別轉入新的種子培養基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中；

④發酵：

將步驟(1)③獲得的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養10-15h；

(2)營養環境中物質的測定：

①培養液的收集：

分別取步驟(1)④獲得的巨大芽孢桿菌培養液、氧化葡糖桿菌培養液和混菌體系培養液1-2mL，以5000-10000rpm的轉速離心，收集上清，并用0.22μm纖維素微孔濾膜過濾，得濾液；

②樣品制備：

取步驟(2)①獲得的濾液10-50μL置于離心管中，加入50-200μL的0.04-0.14mg/ml氘標記的琥珀酸甲醇溶液為內標物，冷凍干燥；加入40-100μL濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反應60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴進行硅烷化反應30-60min；

③GC-TOFMS檢測：