[發明專利]檢測維生素C生產菌株傳代培養過程中營養環境變化的方法

無效

• 申請號: 201210109628.6
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN102634562A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 元英進;高赟;鄒旸;胡夢龍;任恒千
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N30/02;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種檢測維生素C生產菌株傳代過程中營養環境變化的方法，包括如下步驟：

(1)混菌傳代培養：

①固體培養：

取保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)和保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)分別接種于固體培養基上，28-35℃，培養24-48h；

②種子培養：

將經步驟(1)①培養的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌分別轉入種子培養基，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；

將巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌接種到一個新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，使氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩混菌培養，以24-48h為傳代周期，以體積比為1％-10％為傳代比接入新的種子培養基中，傳代100-150天得到混菌細胞，在傳代0-100天或0-150天中選定3-4個時間取樣，取3-4個樣；

③分純：

將步驟(1)②獲得的3-4個樣的混菌細胞劃線分純后再分別接種于固體培養基上，28-35℃培養24-48h；再分別轉入新的種子培養基，在28-35℃，200-280rpm搖床振蕩培養24-48h，分別得到巨大芽孢桿菌種子液和氧化葡糖桿菌種子液；保藏于體積濃度為15-30％的甘油水溶液中；

④發酵：

將步驟(1)③獲得的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌以及將兩種菌混合在一起的混合菌，分別接種到新的種子培養基中，使巨大芽孢桿菌的密度為2×10⁷-2×10¹⁰CFU/mL，氧化葡糖桿菌的密度為2×10⁸-2×10¹¹CFU/mL，在28-35℃，200-280r/min搖床振蕩培養10-15h；

(2)營養環境中物質的測定：

①培養液的收集：

分別取步驟(1)④獲得的巨大芽孢桿菌培養液、氧化葡糖桿菌培養液和混菌體系培養液1-2mL，以5000-10000rpm的轉速離心，收集上清，并用0.22μm纖維素微孔濾膜過濾，得濾液；

②樣品制備：

取步驟(2)①獲得的濾液10-50μL置于離心管中，加入50-200μL的0.04-0.14mg/ml氘標記的琥珀酸甲醇溶液為內標物，冷凍干燥；加入40-100μL濃度為20mg/mL的甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液于30℃-40℃水浴中肟化反應60-120min；再加入50-100μLN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35℃-40℃水浴進行硅烷化反應30-60min；

③GC-TOFMS檢測：

將1μL步驟(2)②獲得的樣品進到氣相色譜儀中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規格為30m×0.25mm?i.d.，進樣口溫度為250℃-280℃，載氣為高純氦氣，流速0.6-0.8ml/min，分流比3∶1-20∶1，柱溫箱升溫程序為：初始50℃-80℃，保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI電離源，源溫230℃-260℃，檢測器電壓2300V-2700V，電離電壓60eV-80eV，電流30μA-50μA；質譜檢測范圍50-800m/z；營養環境物質的鑒定使用NIST?2005數據庫，質譜數據的處理和營養環境物質相對含量的測定使用Masslynx?4.1軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內標物的峰面積對照，得到營養環境物質的相對含量；

(3)主成分分析：

①將步驟(2)獲得的營養環境物質的相對含量的數據進行Pareto預處理；

②用Metlab?7.0(Mathworks.Inc.)軟件對步驟(3)①預處理后的數據進行主成分分析，得到差異營養環境標志物；

(4)過程分析

將差異營養環境標志物的相對含量按照不同傳代時間制成圖表，觀察并分析這些物質變化的規律，檢測出維生素C生產菌株傳代過程中營養環境的變化。