[發(fā)明專利]一種針對(duì)整合酶核心區(qū)去整合反應(yīng)的整合酶抑制劑體外篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210109278.3
• 申請(qǐng)日: 2012-04-13
• 公開（公告）號(hào): CN102618654A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何紅秋;賈渝躍;樂濤;牛小東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶市科學(xué)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/25;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所 50211
• 代理人: 郭云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種針對(duì)整合酶核心區(qū)去整合反應(yīng)的整合酶抑制劑體外篩選方法。

背景技術(shù)

整合酶是HIV-1病毒編碼的一種蛋白質(zhì)，在體內(nèi)通過催化3’加工和鏈轉(zhuǎn)移兩步反應(yīng)，介導(dǎo)病毒DNA和宿主細(xì)胞基因組的整合，其中，鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)是整合酶催化的關(guān)鍵反應(yīng)。研究表明，在體外，應(yīng)用純化的重組整合酶蛋白、分別模擬病毒和宿主細(xì)胞DNA的寡核苷酸鏈，能夠?qū)崿F(xiàn)整合過程。據(jù)此，可以開展整合酶抑制劑的體外篩選，目前，已經(jīng)成功篩選獲得了整合酶抑制劑，且第一個(gè)針對(duì)整合酶的抗艾滋病藥物raltegravir已經(jīng)于2007年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市。整合酶在體外還能夠催化整合過程的逆反應(yīng)，即去整合反應(yīng)，將整合形成的DNA復(fù)合物(整合中間體)還原重新生成病毒DNA和宿主細(xì)胞DNA兩部分，整合酶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域——整合酶核心區(qū)，具有獨(dú)立催化去整合反應(yīng)的活性。目前，針對(duì)HIV-1整合酶核心區(qū)去整合反應(yīng)的整合酶抑制劑體外篩選方法主要有以下幾類：

1、使用放射性同位素標(biāo)記DNA底物的凝膠電泳和放射自顯影方法

Chow等人(Chow?SA，Vincent?KA，Ellison?V，Brown?PO.Reversal?of?integration?and?DNA?splicing?mediated?by?integrase?of?human?immunodeficiency?virus.Science，1992，255(5045)：723-726.)報(bào)道了根據(jù)放射性同位素標(biāo)記DNA底物的放射自顯影方法篩選去整合抑制劑。該方法根據(jù)整合反應(yīng)中病毒DNA與宿主DNA核苷酸序列，合成4條寡核苷酸鏈，在其中一條鏈的末端標(biāo)記放射性同位素32P，寡核苷酸鏈混合后，變性退火形成Y型的去整合DNA底物，模擬鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成的整合中間體。去整合反應(yīng)將整合酶中間體還原為病毒DNA鏈和宿主細(xì)胞DNA鏈，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)變性凝膠電泳后，可以通過放射自顯影觀察到，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物片段在凝膠中的片段大小和位置可以對(duì)產(chǎn)物和反應(yīng)程度定量分析，加入抑制劑后，可通過設(shè)置各種對(duì)照，計(jì)算抑制劑的抑制效果。基于放射性同位素標(biāo)記DNA底物的凝膠電泳和放射自顯影方法具有結(jié)果直觀可靠等優(yōu)點(diǎn)，被稱為黃金標(biāo)準(zhǔn)。該方法主要存在通量低、時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、需特殊設(shè)備和專業(yè)操作人員，易造成放射性污染等缺點(diǎn)。

2、基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)的固相微孔板方法

Gao等人(Gao?K，Wang?S，Bushman?FD.Metal?binding?by?the?D，DX35E?motif?of?human?immunodeficiency?virus?type?1integrase：selective?rescue?of?Cys?substitutions?by?Mn²⁺in?vitro.Journal?of?Virology，2004，78(13)：6715-6722.)報(bào)道了基于ELISA的固相微孔板方法。使用鏈霉親和素包被的微孔板，設(shè)計(jì)的模擬整合中間體的DNA底物兩端分別使用生物素和地高辛標(biāo)記，通過生物素-鏈霉親和素特異性反應(yīng)將DNA底物固定在微孔板中，去整合反應(yīng)還原生成宿主DNA時(shí)將標(biāo)記生物素的鏈合標(biāo)記地高辛的鏈共價(jià)連接。反應(yīng)后通過堿變性即隨后的ELISA檢測(cè)手段，能定量分析反應(yīng)。通過抑制劑對(duì)反應(yīng)影響情況篩選去整合抑制劑。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)高通量，但包被和封閉微孔板耗時(shí)耗力，且封閉易實(shí)效造成高背景信號(hào)及低靈敏度。

3、基于磁珠吸附DNA技術(shù)和ELISA的液相微孔板方法

He等人(He?HQ，Liu?B，Zhang?XY，Chen?WZ，Wang?CX.Development?of?a?high-throughput?assay?for?the?HIV-1integrase?disintegration?reaction.Science?China?Life?Sciences，2010，53(2)：241-247.)報(bào)道了基于磁珠吸附DNA技術(shù)結(jié)合ELISA的液相微孔板方法。該方法在基于ELISA的固相微孔板方法的基礎(chǔ)上，使用同樣的生物素和地高辛標(biāo)記的DNA底物，引入鏈霉親和素磁珠捕獲生物素DNA底物，再通過ELISA檢測(cè)地高辛，據(jù)此分析去整合反應(yīng)并開展整合酶抑制劑篩選。該方法具有固相微孔板方法高通量的優(yōu)點(diǎn)，且背景信號(hào)低，靈敏度特異性高。但是無論固相和液相微孔板方法還是放射自顯影方法，均需要反應(yīng)完全完成后進(jìn)行后續(xù)操作檢測(cè)，步驟繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容