[發明專利]一種針對整合酶核心區去整合反應的整合酶抑制劑體外篩選方法

有效

• 申請號: 201210109278.3
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN102618654A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 何紅秋;賈渝躍;樂濤;牛小東
• 申請（專利權）人: 重慶市科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/25;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所 50211
• 代理人: 郭云

1.一種針對整合酶核心區去整合反應的HIV-1整合酶抑制劑體外篩選方法，包括以下步驟：

(1)整合酶核心區蛋白的制備：

表達純化野生型整合酶核心區蛋白，定量后稀釋為3600nmol/L，分裝保存待用。

(2)去整合DNA底物的制備：

將合成的寡核苷酸鏈1、2、3、4分別按照等摩爾濃度比例混合，震蕩混勻后用鋁箔紙完全封閉避光，置于95℃下孵育5分鐘變性，緩慢冷卻至室溫退火，稀釋為750nmol/L，分裝避光保存待用；所述寡核苷酸序列如下：

寡核苷酸鏈1：5’-CCTCGAAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGTTGCTGAACGAGG-3’

寡核苷酸鏈2：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGGCTGCAGGTCGAC-3’

寡核苷酸鏈3：5’-ACTGCTAGAGGATTTTCCACAT-3’

寡核苷酸鏈4：5’-CAGCAACGCAAGCTTG-3’；

(3)待測化合物樣品的制備：

室溫下將待測化合物樣品用二甲亞砜配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶解后備用；

(4)待測化合物樣品的篩選：

反應體系為50μl/微孔，加入去離子水40μl。微孔板設陰性對照3孔，每孔分別加入2μl二甲亞砜，其他孔中每孔分別加入2μl不同濃度的待測化合物樣品，設陽性對照3孔，加入的5μl蛋白質樣品為高溫變性后的整合酶核心區蛋白，之后所有孔均分別加入5μl整合酶核心區蛋白，振蕩器充分混勻后，在25℃下孵育10～30分鐘，加入去整合DNA底物3μl，振蕩器充分混勻后，在37℃下孵育30分鐘，用熒光分析儀檢測報告基團信號，

按照以下公式計算待測樣品的抑制率：

計算待測樣品的抑制率。

2.根據權利要求1所述一種針對整合酶核心區去整合反應的HIV-1整合酶抑制劑體外篩選方法，其特征在于：所述DNA底物為使用了由熒光基團和淬滅基團標記的DNA底物，DNA底物由寡核苷酸鏈寡核苷酸鏈1、2、3、4混合、變性、退火后制備而成，寡核苷酸鏈序列為：

1：5’-CCTCGAAGTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGTTGCTGAACGAGG-3’中5’端標記5-羧基熒光素，3’端標記4-(4’-二甲基對氨基偶氮苯)苯甲酸；

2：5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCAGGCTGCAGGTCGAC-3’；

3：5’-ACTGCTAGAGGATTTTCCACAT-3’；

4：5’-CAGCAACGCAAGCTTG-3’。

3.根據權利要求1所述一種針對整合酶核心區去整合反應的HIV-1整合酶抑制劑體外篩選方法，其特征在于：所述整合酶核心區蛋白的制備，采用基于磁珠吸附DNA技術結合ELISA的液相微孔板方法中所用的制備方法。