[發明專利]一種α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法

無效

• 申請號: 201210109183.1
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102690859A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 譚強;鄧超澄;韋海宏;陳衛衛;邱春會
• 申請（專利權）人: 廣西中醫學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/085;C12R1/19;C12R1/38
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法。

背景技術

7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic?acid，7-ACA)是頭孢菌素C(Cephalosporin?C，CPC)的母核，是生產50種以上臨床半合成頭孢菌素類抗生素的關鍵原料。目前主要的生產廠家有奧地利的Biochemie公司、意大利的Antibioticos公司和國內主要的中潤藥業，健康元，福抗，山西威奇達，哈藥集團，魯抗醫藥及聯邦制藥等公司。2010年全球的7-ACA需求在4000多噸，而國內7-ACA實際產量達到5500噸左右。因此，如何環保并經濟有效地制備7-ACA，降低生產成本，提高企業競爭力是當前民族醫藥發展亟需解決的關鍵問題。

當前7-ACA主要通過化學法或酶法裂解CPC獲得。化學裂解CPC制備7-ACA存在嚴重的能耗與治污成本問題，目前已逐步被酶裂解法所取代。國內外已經工業化的是雙酶兩步法。關于該工藝路線，首先，利用D-氨基酸氧化酶(DAAO)在一定的條件下將CPC氧化脫氨，生成α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸(AKA-7-ACA)和過氧化氫酶(CAT)，AKA-7-ACA這個中間體是很不穩定的，很容易被同時生成或另外加入的過氧化氫氧化脫羧生成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic?Acid，GL-7-ACA)。GL-7-ACA這個中間體在GL-7-ACA酰化酶的作用下脫去側鏈生成7-ACA。雙酶兩步法具有生產工藝簡單、環境污染少、生產條件溫和、生產成本低廉，且產品質量穩定等優勢。該工藝需要涉及到2～3個反應器。隨著7-ACA產品日益嚴峻的國際競爭壓力，為縮短生產工藝方法以進一步降低7-ACA的生產成本，人們對一步法生產7-ACA(單罐生產法)的研究極為關注。

目前所報道的一步法工藝包括兩個方面：第一、單酶一步法：通過一種單酶(頭孢菌素C酰化酶，Cephalosporin?Cacylase)轉化CPC生產7-ACA。雖然投入了大量的資源從事近40年的研究，然而至今發現的頭孢菌素C酰化酶存在酶活力低，還無法滿足工業化生產的要求，而通過基因克隆技術也無法實現該酶活力有實質性的提高，該酶基因結構很復雜。第二、雙酶一步法：利用DAAO和Gl-7-ACA酰化酶協同作用轉化CPC一步法生產7-ACA。該工藝可獲得較好的7-ACA產率，但由于反應體系存在過氧化氫，使得酶催化劑的穩定性受到嚴重影響。

最近，三酶法裂解CPC生產7-ACA的工藝已經被提出，其工藝就是通過DAAO和CAT協同作用催化CPC產生AKA-7-ACA，該中間產物在無戊二酸的條件下可被Gl-7-ACA酰化酶水解產生7-ACA，這就避免了過氧化氫對反應體系的不利影響。

三酶法工藝存在一個需解決的問題，就是Gl-7-ACA酰化酶對AKA-7-ACA的酶活性較低(該酶對AKA-7-ACA的米氏常數Km值是其對GL-7-ACA?Km值的4倍)，使得最終的7-ACA產率只有76～80％，與工業化生產的要求還有一些距離，因為工業化的雙酶兩步法7-ACA產率≥86％。這樣，獲取高活力水解AKA-7-ACA的酰化酶將具有巨大的經濟利益，將掀起國際上研究的一個高潮。

高活力水解AKA-7-ACA的酰化酶的獲得可以通過兩種方法：第一、從自然界篩選酶產生菌；第二、通過定向進化技術對Gl-7-ACA酰化酶、CPC酰化酶或青霉素G酰化酶分子結構改造，獲得AKA-7-ACA水解活力較強的突變酶。但不管何種策略，都將涉及到一個技術手段——篩選系統的建立。

AKA-7-ACA是很不穩定的，在條件為28℃、pH?8.0時，半衰期僅為5h。本發明制備了AKA-7-ACA的兩個結構類似物，即己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸(adipoyl-7-ADCA)和酮己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸(Keto-7-ADCA)。這三個化學結構有相同的β-內酰胺母環、相同或相近的環上六碳烷基側鏈，都是Gl-7-ACA酰化酶水解的底物。酰化酶對這三種化學結構的底物特異性(或專一性結合)是相同的。兩個結構類似物的穩定性高于AKA-7-ACA的1～2數量級。這樣，這兩個結構類似物代替AKA-7-ACA作為篩選酶產生菌的誘導底物。蠟樣芽胞桿菌對adipoyl-7-ADCA和Keto-7-ADCA不敏感，但對7-ADCA敏感。

發明內容