[發明專利]一種α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法

無效

• 申請號: 201210109183.1
• 申請日: 2012-04-16
• 公開（公告）號: CN102690859A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 譚強;鄧超澄;韋海宏;陳衛衛;邱春會
• 申請（專利權）人: 廣西中醫學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/085;C12R1/19;C12R1/38
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 朱萍球

1.一種α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：其篩選過程包括：

(1)α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸及其結構類似物的制備，所述結構類似物是己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸和/或酮己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸；

(2)篩選系統指示菌的選擇與培養、候選菌富集培養及正負對照菌株的選擇與培養；

(3)三層瓊脂平板培養基篩選系統的制備；

(4)目標α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的判斷，所述判斷的方法是目標α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌通過三層瓊脂平板培養基培養有無出現蠟樣芽胞桿菌的抑菌圈的來判定。

2.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸的制備是將重量含量為2％頭孢菌素C用0.1～0.2mol/L的磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液pH值為7.5，然后放入反應器中，加入40U的D-氨基酸氧化酶和2000U的過氧化氫酶，反應過程通入純氧，啟動攪拌裝置，溫度控制在27～29℃下，反應2～2.5h后離心收集反應液，對反應液進行濃縮結晶得到α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸。

3.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述酮己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸的制備是將重量含量為2％去乙酰氧基頭孢烷酸用0.1～0.2mol/L的磷酸緩沖液溶解，磷酸緩沖液pH值為7.5，然后放入反應器中，加入40U的D-氨基酸氧化酶和2000U的過氧化氫酶，反應過程通入純氧，啟動攪拌裝置，溫度控制在27～29℃下，反應2～2.5h后離心收集反應液，對反應液進行濃縮結晶得到酮己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸。

4.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸的制備是己二酰氯緩慢地滴入pH值為8～9的7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸堿性溶液中，在攪拌狀態下加入小蘇打固體，控制反應的pH值不變，反應2～3h后離心收集反應產物，進行干燥、結晶得到己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸。

5.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述候選菌富集培養是指將假單胞菌放入含10～12mmol/L己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸的富集培養基中富集培養16～24h；然后稀釋涂布在LB瓊脂平板培養基上，在35～37℃的條件下培養16～24h，獲得候選菌的單菌落細胞。

6.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述篩選系統指示菌是蠟樣芽胞桿菌，其培養是將單菌落的蠟樣芽胞桿菌培養在LB液體培養基活化后，在35～37℃的條件下培養15～17h。

7.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述正負對照菌株分別是硝基還原假單孢菌和大腸桿菌，其培養是分別將單菌落的硝基還原假單孢菌和大腸桿菌挑出，在LB瓊脂平板培養基上劃線培養，在34～36℃的條件下培養16～24h，獲得硝基還原假單孢菌單菌落細胞和大腸桿菌單菌落細胞。

8.根據權利要求1或5所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第一層瓊脂平板培養基的制備：15～16mL?LB培養基倒平板，其瓊脂含量為1.5％，候選菌通過點接種至平板培養基中，同時硝基還原假單孢菌和大腸桿菌也點接種至平板培養基中分別作為正、負對照，該平板培養基在35～37℃條件下培養12～24h使菌落長出。

9.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第二層瓊脂平板培養基的制備：在低于45℃的條件下半固體培養基均勻地覆蓋在第一層瓊脂平板培養基上，其用量是3～5ml，覆蓋的厚度為0.3～0.6mm，在35～37℃下對菌株培養4～5h；所述半固體培養基含的瓊脂為0.5～0.6％，己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸或酮己二酰-7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸5～6mg/ml。

10.根據權利要求1所述的α-酮己二酰-7-氨基頭孢烷酸酰化酶產生菌的篩選方法，其特征在于：所述三層瓊脂平板培養基篩選系統中第三層瓊脂平板培養基的制備：在低于45℃的條件下，將含有瓊脂含量為0.5～0.6％，蠟樣芽胞桿菌含量為0.01～0.02％的半固體培養基均勻地覆蓋在第二層瓊脂平板培養基上，其用量是3～5ml，覆蓋的厚度為0.3～0.6mm，在28～32℃的條件下培養11～12h。