[發(fā)明專利]一種快速檢測水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210108559.7
• 申請日: 2012-04-15
• 公開（公告）號: CN102605096A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邢秀梅;楊福合;査代明;榮敏;蘇偉林;吳瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 邢秀梅
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明公開一種快速檢測水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，特別涉及檢測鹿產(chǎn)品中是否含有水鹿產(chǎn)品的成分，用于快速準(zhǔn)確識別鹿產(chǎn)品，屬于生物檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鹿產(chǎn)品是鹿的一些組織或者器官，主要包括有：鹿茸，鹿心，鹿腎，鹿胎，鹿筋，鹿鞭，鹿尾，鹿肉和鹿血等。由于鹿產(chǎn)品大多為名貴中藥材，價格昂貴，所以市場上屢見用偽劣產(chǎn)品來冒充名貴的鹿產(chǎn)品。

目前，鹿產(chǎn)品的鑒定大多采用傳統(tǒng)方法，主要包括性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定。雖然傳統(tǒng)鑒定方法簡單、快捷、成本低，但影響傳統(tǒng)鑒定方法的因素很多（如人為因素、環(huán)境因素、營養(yǎng)因素），因而不能準(zhǔn)確地判斷鹿產(chǎn)品的偽劣情況。比如在鹿產(chǎn)品的加工過程中，其性狀、顯微結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等常常發(fā)生改變，利用傳統(tǒng)鑒定方法來鑒定鹿產(chǎn)品可能會出現(xiàn)誤判。然而，分子鑒定方法（基于DNA的方法）不受這些因素的影響，且具有準(zhǔn)確性大、靈敏度高、穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一種快速檢測水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，解決了鹿產(chǎn)品中是否含有水鹿成分的問題。

本發(fā)明還提供了上述快速檢測鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒的制備方法，通過一個PCR方法反應(yīng)體系采用一步反應(yīng)來鑒別鹿產(chǎn)品中的水鹿源性成分。

本發(fā)明提供的快速檢測水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒，其特征在于：

包括DNA提取液、PCR反應(yīng)液和陰性標(biāo)準(zhǔn)品：

所述的DNA提取液：

（1）低鹽緩沖液（pH?7.6-7.8）：12-13份Tris堿（三羥甲基氨基甲烷），32-35份?Na₂EDTA（乙二胺四乙酸二鈉），7-8份MgCl₂，4-5份NaCl,余份為水；

（2）細(xì)胞裂解液：4-6份?SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份Triton?X-100(聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；

所述的PCR反應(yīng)液：

ddH₂O?、10?×?PCR?Buffer?、dNTPs?、上游引物、下游引物、Taq酶；

具體引物序列為：

上游引物：5’-ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3’

下游引物：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’

陰性標(biāo)準(zhǔn)品：為無菌雙蒸水。

本發(fā)明所述快速檢測水鹿源性鹿產(chǎn)品的PCR試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1）DNA提取液

（1）低鹽緩沖液（pH?7.6-7.8）：12-13份Tris堿（三羥甲基氨基甲烷），32-35份?Na2EDTA（乙二胺四乙酸二鈉），7-8份MgCl2，4-5份NaCl,余份為水；

（2）細(xì)胞裂解液：4-6份?SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份Triton?X-100(聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；

2）PCR反應(yīng)液。

（1）引物設(shè)計：在水鹿的線粒體DNA?D-loop區(qū)域，設(shè)計一對特異性引物，包括一個上游引物和一個下游引物。序列如下：

上游引物：5’-ATAACCTTGCATACTCGCGGTGC-3’

下游引物：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’

（2）PCR反應(yīng)液：

ddH₂O??9.3ul，10?×?PCR?Buffer??1.5ul，dNTPs(100?uM)??2.0ul，上游引物(20?uM)??0.5ul，下游引物?(20?uM)???0.5ul，Taq酶(5U/ul)???0.2ul。

（3）陰性標(biāo)準(zhǔn)品：為無菌雙蒸水。

本發(fā)明的水鹿源性鹿產(chǎn)品PCR檢測的使用方法：

（1）從待檢樣品中提取基因組DNA；

（2）制備PCR反應(yīng)體系：

取步驟(1)中的DNA?1ul和陰性對照加入到PCR反應(yīng)液中，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增；

（3）設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序均如下：

94℃??5min；94℃??30s，60℃??30s，72℃??30s，72℃??5min，擴(kuò)增30個循環(huán)。

（4）反應(yīng)結(jié)束后取5?μl?PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，紫外燈下觀察結(jié)果。