[發明專利]肝實質細胞及其制備、鑒定與應用方法

有效

• 申請號: 201210107490.6
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN103374546B
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 鄧宏魁;趙東昕;陳松
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38;C12Q1/02;C12Q1/6881;C12Q1/04;G01N33/68
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張國梁

本發明公開了一種肝實質細胞及其制備、鑒定與應用方法。本發明提供制備肝實質細胞的方法，包括如下步驟：1)將多潛能干細胞培養獲得內胚層細胞；2)將獲自步驟1)的內胚層細胞培養獲得原始腸管細胞；3)將獲自步驟2)的原始腸管細胞培養獲得成肝細胞；其特征在于：將獲自步驟2)的細胞進行傳代，并轉入到在含有成纖維細胞生長因子(FGF)和骨形態形成蛋白(BMP)的肝細胞誘導培養基I中培養，獲得成肝細胞；4)將獲自步驟3)的成肝細胞培養獲得成熟的肝實質細胞。本發明還涉及根據所述方法制備的肝實質細胞。本發明制備的肝實質細胞較以往具有更高的代謝活性，制備效率高，應用前景廣闊。

技術領域

本發明涉及肝實質細胞及其制備、鑒定與應用方法。

背景技術

肝臟在人體內代謝過程中起到重要的作用，包括糖原合成，尿素合成，脂肪代謝調控，以及藥物解毒等等。肝臟細胞的損傷包括肝炎，肝癌，肝硬化會對人體生命安全造成極大的危害。要解決這種問題，就要能在體外獲得大量肝臟細胞，利用這些細胞進行移植。在各種細胞來源中，人多潛能干細胞(pluripotent stem cells,PSCs)，包括人胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESC)和人誘導多能性干細胞(induced pluripotent stemcells，iPSC)，最具有應用潛力，人胚胎干細胞具有無限增殖的能力和分化的全能性，在合適的條件下可以分化為人體的各種細胞類型(Thomson et al.,Science.1998Nov 6；282(5391):1145-7)，是治療各種退行性疾病的較好的供體細胞來源。另外，考慮到肝臟毒性是新藥設計和檢測中最重要的問題之一，大量的肝實質細胞來源可以極大推動建立新的藥物的篩選策略。

經過十多年來的研究，目前人們在誘導人多潛能干細胞向肝實質細胞分化方面已經取得一定的進展。2007年我們在誘導人干細胞向肝臟細胞分化方面獲得了較大的突破(Cai et al.,Hepatology.2007May；45(5):1229-39)。我們首先將整個的分化過程按照體內發育的模式劃成幾個階段。首先利用Activin A有效的將胚胎干細胞誘導成內胚層細胞。然后參照體內發育的信號通路，激活FGF和BMP兩條信號通路，促使內胚層細胞轉變為早期肝母細胞。然后通過HGF的刺激促進肝母細胞的進一步分化，最后利用OSM和Dexamethasone促進肝實質細胞的成熟。這樣逐步誘導的方案可以非常高效的產生肝實質細胞，得到的肝臟細胞占全體誘導物的70％左右。并且，這些人胚胎干細胞來源的細胞表達肝臟特異的標志基因和參與肝臟代謝功能的酶，能夠分泌白蛋白，儲存糖原，吸收并代謝吲哚花青綠，分泌低密度脂蛋白，并且能被HCV假病毒感染。移植試驗發現人胚胎干細胞來源的肝臟細胞可以在免疫缺陷型的小鼠肝內維持至少兩周。這些實驗證明人胚胎干細胞可以高效率的分化成具有一定功能的肝臟實質細胞，將胚胎干細胞向肝臟細胞的分化推向了一個新的高度。隨后，我們還進一步證明該分化方案也可以適用于人誘導多能性干細胞向肝實質細胞分化(Song et al.,Cell Research 2009Nov；19(11):1233-42)。最近，其他的實驗組也報道了高效分化人多潛能干細胞得到肝臟細胞的實驗方案。Stephen A.Duncan，Ludovic Vallier和Ian Wilmu等小組利用類似的分步誘導方法都得到了分泌白蛋白的肝臟細胞，并且能初步的檢測到成熟肝細胞表達細胞色素P450酶。此外，Hesham Basma等人利用肝細胞表面特異標志ASGPR分選純化從人ESC分化的來的肝細胞并移植到小鼠體內能看到明顯的人源細胞重建小鼠肝臟并分泌人源的白蛋白。