[發明專利]肝實質細胞及其制備、鑒定與應用方法

有效

• 申請號: 201210107490.6
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN103374546B
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 鄧宏魁;趙東昕;陳松
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61L27/38;C12Q1/02;C12Q1/6881;C12Q1/04;G01N33/68
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張國梁

1.制備肝實質細胞的方法，包括如下步驟：

1)將多潛能干細胞培養獲得內胚層細胞；

2)將獲自步驟1)的內胚層細胞轉入到原始腸管誘導培養基中進行培養，獲得原始腸管細胞；

3)將獲自步驟2)的細胞進行傳代，并轉入到在含有成纖維細胞生長因子-7，骨成型蛋白-2和骨成型蛋白-4的肝細胞誘導培養基I中培養，檢測所獲得的細胞的PROX1和HNF6的表達，獲得表達PROX1和HNF6的成肝細胞；

4)將獲自步驟3)的成肝細胞培養獲得成熟的肝實質細胞，

其中所述多潛能干細胞為誘導多能性干細胞，即iPS細胞，或下述任一種NIH編號的細胞系的細胞：BG01,BG02,BG03,BG04，SA01,SA02,SA03，ES01,ES02,ES03,ES04,ES05,ES06，TE03,TE32,TE33,TE04,TE06,TE62,TE07,TE72，UC01,UC06，WA01,WA07,WA09,WA13和WA14。

2.權利要求1所述的方法，其中所述步驟2)包括：將獲自步驟1)的細胞轉入到含有成纖維細胞生長因子(FGF)和轉化生長因子(TGF-b)信號通路的小分子抑制劑的原始腸管誘導培養基中進行培養，從而獲得原始腸管細胞。

3.權利要求1或2所述的方法，其中所述原始腸管誘導培養基包含成纖維細胞生長因子-7和轉化生長因子信號通路的小分子抑制劑SB431542。

4.權利要求1或2所述的方法，其中所述多潛能干細胞為誘導形成的多潛能干細胞。

5.權利要求1所述的方法，其中產生共表達HNF4A和PROX1的成肝細胞的效率大于60％。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述多潛能干細胞為哺乳動物細胞。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述多潛能干細胞為小鼠或人細胞。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述多潛能干細胞為人細胞。

9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法獲得的肝實質細胞。

10.權利要求9所述的肝實質細胞，所述細胞分泌白蛋白，所分泌的白蛋白水平達到人原代成體肝實質細胞分泌白蛋白的水平。

11.權利要求10所述的肝實質細胞，所述細胞還具有選自儲存糖原、產生細胞色素P450酶，進行一相、二相代謝，三相轉運中的一項或多項功能。

12.權利要求9-11中任一項所述的肝實質細胞在藥物代謝研究、藥物的毒性測試或藥物篩選中的應用。

13.鑒定具有代謝功能的肝實質細胞的方法，其特征在于所述方法包括檢測PROX1和HNF6在肝實質細胞中的表達的步驟。

14.PROX1和HNF6在制備用于鑒定具有代謝功能的肝實質細胞的試劑盒中的應用。