[發明專利]一種檢測腎上腺激素含量的方法

無效

• 申請號: 201210107015.9
• 申請日: 2012-04-13
• 公開（公告）號: CN102680617A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 楊亞玲;秦慧
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: G01N30/36
• 分類號: G01N30/36
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種有效的新型分散液液微萃取高效液相色譜法檢測生物樣品中腎上腺素含量的方法，屬于分析化學中痕量生物大分子的分離富集和分析測定技術領域。

背景技術

腎上腺素分為糖皮質激素和鹽皮質激素，糖皮質激素常見的有氫化可的松，地塞米松，倍他米松，曲安奈德，倍氯米松，苯丙酸諾龍等。現在中國，日本，歐盟都對糖皮質激素規定了最大殘留量，而且我國還將部分糖皮質激素規定為違禁藥物。近年來由于新的萃取凈化處理技術，更加靈敏的檢測技術獲得了更多的樣品處理簡單，回收率更高的分離萃取技術，以及檢測限更低，準確性和靈敏度更高的檢測方法。

分散液液微萃取(DLLME)于2006年首次提出，是一種基于合適萃取劑的簡單快捷的樣品前處理技術。只有極微量的有機溶劑和分散劑在萃取劑和水相中，萃取劑和分散劑快速進入到待被分析物的水相中，形成乳濁液。在乳濁液中被誘導形成微小的一滴，通過離心，微小的一滴被富集到試管底部。然后與分析儀器聯用。該技術易操作，成本低，環境友好，需用樣品少，已經成為非常有潛力的樣品前處理技術之一。

現有的檢測腎上腺素的方法主要有高效液相色譜法、生物檢測法，其中樣品前處理是制約檢測靈敏度、選擇性提高的瓶頸，目前腎上腺素檢測使用的樣品前處理技術主要有液液萃取、固相萃取、固相微萃取等。本發明采用的分散液液微萃取在已有技術的基礎上，一是采取表面活性劑做分散劑，提高分散效果及萃取率，縮短萃取時間；二是將腎上腺素與水揚醛發生衍生反應，改變腎上腺素性質，提高萃取效果，同時由于衍生物共扼體系增大，增強檢測信號強度，提高檢測靈敏度。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測生物樣品中腎上腺激素含量的新方法，該方法對基體復雜的生物樣品先采用水楊醛與腎上腺激素發生衍生反應，再用分散液液微萃取對衍生產物進行富集，結合高效液相色譜同時測定多種痕量腎上腺素，具有操作簡單，富集倍數高，結果準確等特點。

本發明分散液液微萃取高效液相色譜法檢測生物樣品中腎上腺素含量的方法，包括以下步驟：

（1）工作曲線的制作：配制一系列不同濃度的腎上腺素混合標準溶液，在一定色譜條件下，注入高效液相色譜進行分析，制作工作曲線，得到腎上腺素的檢測限和線性回歸方程；一般采用的配制濃度為1.00、10.00、50.00、100.00、150.00、200.00、250.00、300.00?ng/mL。

（2）樣品處理：在待測生物樣品中加入1～2ml乙腈、0.1～0.5g氯化鈉、0.1～0.5g氯化鋅、0.1～0.5g醋酸鈉、0.1～0.5g硫酸鎂試劑中一種，混勻，在轉速5000～12000r/min下離心10～20min，取出上清液，用pH?5.5～8.0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液稀釋至5ml，備用；

（3）分散液液微萃取：將100-300μL萃取劑，0.5-1.0mL?5%(w/v)衍生試劑水楊醛和0.5?-1.0mL?0.05%～0.1%?(v/v)分散劑混勻，立即加入備用樣品5mL上清稀釋液中，超聲，形成乳濁體系；然后在3000～8000?r/min下離心2～10?min，離心后離心管底形成一滴有機相；

（4）樣品測定：吸取步驟（3）中離心管底部的有機相過濾，在與步驟（1）相同色譜條件進行HPLC分析，并對照步驟（1）所得的線性回歸方程，計算出樣品中的腎上腺素含量。

本發明中腎上腺素為地塞米松、曲安奈德、丙酸倍率米松、丁酸氫化可的松、苯丙酸諾龍、潑尼松、醋酸可的松、甲基潑尼松龍中一種或幾種。

色譜流動相為：色譜條件為以乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相，梯度洗脫為質量百分比濃度80％乙腈洗脫第0～3?min，質量百分比濃度80％～90％乙腈洗脫第3～6.5?min，質量百分比濃度90％乙腈洗脫第6.5～8?min。

本發明中生物樣品為全血或尿液，檢測前在-20℃下保存備用，血液處理量為0.5～1.0ml，尿液的處理量為5.0ml。

本發明中萃取劑為二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳中一種。

本發明中分散劑為甲醇、乙腈、丙酮、非離子表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚Triton?X系列、非離子表面活性劑醇聚氧乙烯醚中一種。?

本發明中非離子表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚Triton?X系列試劑為Triton?X-100或Triton?X-114。

本發明中非離子表面活性劑醇聚氧乙烯醚為Tergitol?TMN-6。

本發明方法的最低定量限為0.010ng/mL。