[發明專利]一種提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制備方法

無效

• 申請號: 201210106866.1
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN103667321A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 鄒國源;陳琍;高文霞
• 申請（專利權）人: 上海鉑嵋生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/70;C12N9/12;C07K7/06;C07K16/40
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域??本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制備及抗體篩選的方法。

背景技術??近年來腫瘤生物學技術的進展，發現許多新型的腫瘤診斷生物標志物。M2型丙酮酸脫氫酶激酶(PKM2)是目前腫瘤研究領域最為熱門的一個腫瘤生物標志物，它作為腫瘤細胞糖酵解代謝通路的關鍵酶，與腫瘤發生發展密切相關。它在正常組織中僅表達于肌肉和快速增生組織，在腫瘤組織顯著高表達，是許多腫瘤細胞共性的特征。丙酮酸激酶有四種亞型：PKM1、PKM2、PKL及PKR。PKM1主要表達于分化成熟的組織如肌肉和神經組織，PKM2主要表達于快速增生的細胞，如胚胎干細胞、正常快速增生細胞及腫瘤細胞等，PKL主要表達于肝臟、腎臟及結腸，PKR表達于紅細胞中。

結腸癌中PKM2的高表達，常隨著腫瘤細胞的脫落，可在糞便中被檢測到，因此可作為結腸癌的診斷生物標志物。以往對結腸癌的篩查和診斷，常通過糞便中的隱血試驗，然而隱血試驗由于取樣的誤差及飲食因素影響等，常導致較高的假陽性率和假陰性率。近幾年的臨床研究發現，糞便中的PKM2檢測可顯著提高結腸癌的診斷準確率，靈敏度達80％，特異性達92％，因此將成為今后結腸癌的篩查和診斷的重要生物標志物。血液中PKM2的表達增加，提示有腫瘤的發生，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌等。此外，尿液中的PKM2增加，提示患有腎癌，這是第一個有希望作為腎癌的腫瘤生物標志物。綜上所述，PKM2是一個重要的腫瘤生物標志物，糞便中的PKM2檢測可幫助診斷結腸癌等胃腸道腫瘤，尿液中PKM2的檢測可輔助診斷腎癌，血液中PKM2的檢測可輔助診斷乳腺癌及肺癌等。

目前PKM2的檢測試劑盒僅德國的ScheBo·Biotech?AG公司有生產相關診斷產品，主要有用于結腸癌篩選的檢測試劑盒及血清中PKM2的檢測試劑盒，其產品“免疫層析法快速檢測試劑盒”能在數分鐘內檢測糞便中的PKM2含量，現已用于各醫院的臨床檢測。此產品由于價格比較昂貴，若進口到國內在醫院中使用，其昂貴的價格普通病人難以承受，因此也不便在人群中推廣。其它如Abcam等科研試劑公司提供的PKM2抗體，僅限于科研使用，價格昂貴，且無親和力、特異性和靈敏度較高的抗體用于臨床檢測。因此，我國必須開發具有自主知識產權的PKM2檢測試劑盒，降低試劑盒的成本，以便能在國內進行推廣和普及，使結腸癌等腫瘤能夠早期發現早期治療，提高腫瘤治療的有效率，能夠服務于人民群眾的健康事業。目前，PKM2的檢測試劑盒的開發主要有兩種方法：一是常用的酶聯免疫法(ELISA)檢測試劑盒，二是基于免疫層析法的快速檢測試劑盒。其相關產品均可用于臨床的檢測。因此，本申請的研究也開發兩種診斷試劑盒，分別為常規的酶聯免疫法檢測試劑盒和膠體金免疫層析法的快速檢測試劑盒。兩種類型的檢測試劑盒，從價格和便利性方面滿足臨床上不同的實際需求。

由于PKM2僅在氨基酸序列的389-433位與PKM1存在差異(見說明書附圖2)，因此需取這部分氨基酸進行作為抗原。而這特異的45個氨基酸序列，由于其片段較小，因此免疫原性較差。本申請的研究策略是將45個氨基酸的抗原序列連接在帶有GST標簽的pET24a載體上，促進蛋白的正確折疊，提供蛋白的得率及純化，同時有利于提高抗體的免疫原性，并且可作為初步的抗體篩選所用。在抗體的篩選階段，合成不同表位的肽段，用于篩選特異性和親和力高的抗體，用于后續的試劑盒開發。這樣的一種針對M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制備方法，即克服了蛋白免疫原性差的弱點，也有利于目的蛋白的獲取和后續抗體的篩選，因此鑒于以上的技術背景，提出本發明方法。

發明內容??本發明的目的就是提供一種能簡便、高效地進行PKM2蛋白在原核系統中的制備工藝。該發明使得PKM2蛋白的免疫原性增強，增加了抗PKM2蛋白抗體的多樣性。該發明簡單易行，適用于低分子量蛋白的表達、純化和抗體制備。同時，本發明合成PKM2的多種獨特的多肽序列，用于高特異性和高親和力抗體的篩選，減少非特異性抗體，提高抗體的篩選效率。

本發明的內容主要由兩部分組成：

1.構建pET24a-GST-PKM2-A的重組蛋白，用于動物的抗原免疫。本申請使用的pET24a載體，已經構建有帶有GST的標簽。PKM2-A片段的序列為：IYHLQLFEELRRLAPITSDPTEATAVGAVEASFKCCS?GAIIVLTK。特異序列見說明書附圖1。