[發明專利]微生物發酵生產谷氨酸脫氫酶的方法

無效

• 申請號: 201210106727.9
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102653736A
• 公開（公告）日: 2012-09-05
• 發明（設計）人: 張慶芳;遲乃玉;竇少華;王曉輝;于爽;石淑鈺
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06
• 代理公司: 大連智慧專利事務所 21215
• 代理人: 劉琦

技術領域

本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種谷氨酸脫氫酶微生物發酵生產方法。該發明生產的谷氨酸脫氫酶主要應用于臨床肝炎、胃病、胰腺炎的診斷以及其它谷氨酸脫氫酶醫用診斷行業。鑒于谷氨酸脫氫酶是一種微生物產生的蛋白質，且無毒、無副作用，可以廣泛應用于醫用診斷試劑盒的生產。

技術背景

谷氨酸脫氫酶(Glutamate?dehydrogenase，簡寫為GDH)是一種依賴輔酶的不需氧脫氫酶，在氨基酸代謝中占有重要地位。它分為NADH依賴型(EC.1.4.1.2)、NAD(P)H依賴型(EC.1.4.1.3)和NADPH依賴型(EC.1.4.1.4)三種類型，廣泛存在于動物、植物和微生物中，并廣泛應用于臨床肝炎、胃病、胰腺炎等疾病診斷行業中(胡漢寧等，武漢大學學報，2001)，目前檢測肝病的酶制劑主要是谷丙轉氨酶(ALT)，但其特異性較差，不能完全反映肝細胞損壞程度(郭紹麗等，中國中西醫結合消化雜志，2001)。隨著GDH試劑盒在醫用診斷行業的應用，以及其GDH特異性高，無毒副作用等優點，使其更適于常規肝功能測定及其他疾病檢測項目，特別是慢性肝病患者肝損傷程度判斷、療效觀察和病情監測的疾病監測項目(曹燕等，上海醫學檢驗雜志，2003)。早期生產GDH的方法是從動物臟器中提取，所得酶系復雜，很難得到高純度的酶(王燕等，生物工程學報，2003)，而通過微生物發酵法則容易制得。目前關于微生物GDH研究主要集中在菌株選育、發酵條件優化、酶學性質，酶分離純化及基因克隆等研究階段(王燕等，生物工程學報，2003)，而微生物發酵生產GDH的產業化、規模化還未見報道。微生物發酵生產的GDH純度高，發酵生產工藝簡單，提取步驟簡易，酶的純化工藝穩定，生產不受原料來源影響，更適用于批量生產，且微生物發酵生產的GDH在醫用診斷、檢測精密度上要高于其他方法生產的GDH。因此，微生物發酵生產的GDH具有非常廣闊的開發潛力和應用前景。

發明內容

本發明是提供一種微生物發酵生產GDH的方法，該發明主要是微生物經過產物定向馴化后，在24～30℃液體發酵生產GDH的方法，這種生產方法獲得的GDH液活性可以達到145U/mL，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該方法生產的微生物發酵GDH操作簡單、方便、快捷、成本低，可以從根本上避免動物組織提取的繁瑣工藝和昂貴的設備。

本發明所述的一種微生物發酵生產谷氨酸脫氫酶的方法具體包括以下步驟：

(1)將產生谷氨酸脫氫酶的微生物進行6～10次活化，再經過產物定向馴化4～6次，使其在24～30℃環境條件下生長良好；

(2)按常規方法將產物定向馴化后的谷氨酸脫氫酶產生菌在24～30℃逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；

(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在24～30℃培養60～114h時，即微生物發酵生產谷氨酸脫氫酶結束；

(4)將(3)的發酵液在6,000～8,000rpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數次之后離心收集沉淀；

(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000～14,000rpm離心，收集到的上清為谷氨酸脫氫酶粗酶液；

(6)根據不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。

本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。谷氨酸脫氫酶產生菌(CGMCC菌種編號：1.495或1.581)，菌株先活化、定向馴化后，按本發明產酶條件發酵生產谷氨酸脫氫酶，定向馴化后的菌株在4℃環境中可保存2個月，用10～25％甘油制成的菌懸液、在零下80℃條件下可以長期保藏。

具體實施方式

實施例一：

(1)培養基制備

①菌種活化培養基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，NaCl?5.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1.0L，pH值7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌30min。

②菌種定向馴化培養基：葡萄糖8.0～12.0g，蛋白胨18.0～22.0g，牛肉膏16.0～24.0g，NaCl?4.0～6.0g，pH值自然，121℃高壓蒸汽滅菌30min。