[發明專利]一種利用內含肽制備胸腺素多肽的方法

有效

• 申請號: 201210106698.6
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102676534A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 周亮;祝君;洪亮
• 申請（專利權）人: 上海育臣生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/62;C07K14/575;C07K1/22;C07K1/20
• 代理公司: 上海信好專利代理事務所(普通合伙) 31249
• 代理人: 賈慧琴

技術領域

本發明涉及一種制備胸腺素多肽的方法，具體涉及一種通過胸腺素α-1與內含肽融合表達、融合蛋白在內含肽介導下斷裂釋放出胸腺素多肽的方法，即利用內含肽制備胸腺素多肽的方法。

背景技術

胸腺素alpha?1（Thymosin?α-1）是由28個氨基酸殘基組成的多肽，等電點為4.2，無二級結構無二硫鍵，唯一的修飾是N-末端乙酰化。胸腺素α-1的氨基酸序列為：N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C，它是一種針對T淋巴細胞的免疫增強劑，可以使T細胞成熟和分化，可促使成熟的T細胞、NK細胞分泌各種淋巴因子如白介素-2、γ-干擾素，也可以同時促進白介素-2受體的生成。

胸腺素α-1作為一種免疫增強劑，主要用于治療免疫缺陷和免疫抑制類疾病。當病人患癌癥或感染某些病毒如HIV、HBV或經過放化療后，其免疫系統往往會被逐漸抑制甚至破壞，而不能發揮對病毒或癌細胞的正常殺傷作用。胸腺素α-1可以恢復T淋巴細胞的功能，促進成熟T細胞的增殖，促進淋巴細胞在病原組織及癌細胞周圍的聚集，促進淋巴因子及淋巴因子受體的產生，增強免疫細胞的作用，提高機體對病毒和癌癥的抵抗能力。

胸腺素α-1在醫療上的應用主要有以下幾個方面：(1)癌癥的治療，已證實其對惡性黑色素瘤、肺癌、白血病、鱗狀上皮細胞癌、直結腸癌有效；(2)病毒性肝炎（HBV）的治療；(3)艾滋病病毒(HIV)的治療；（4）放療和化療病人的免疫系統恢復。胸腺素α-1不僅對多種惡性腫瘤、病毒性肝炎、HIV等常見、多發、高死亡率性的疾病有良好的治療和緩解作用，還在新生兒免疫、老年人醫療保健方面具有很大的應用潛力。

目前，國內制備胸腺素α-1常用的方法是從動物的胸腺中提取，這種方法的缺點是操作復雜，提取純度不高，且來源受動物數量限制。國外制備胸腺素α-1常用的方法是化學合成法，該方法的缺點是成本較高且容易造成環境污染。

本發明的目的是利用基因工程技術，根據胸腺素α-1的氨基酸序列，推導并合成其編碼核苷酸序列，以融合的方式與純化標簽、內含肽同時表達，利用純化標簽快速純化出融合蛋白；利用內含肽自切割去除純化標簽獲得胸腺素多肽。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于制備胸腺素多肽的方法，將胸腺素和內含肽融合表達，克服多肽因其分子量太小難以在常用的原核表達系統如大腸桿菌中表達，以及即使能夠表達也因宿主內蛋白酶的水解導致多肽產物不均一的問題，且后期純化只需改變融合蛋白溶液的pH等條件，即能使內含肽與胸腺素斷裂，釋放出胸腺素。該方法可以大量制備胸腺素，且成本低、無污染，適宜工業化大生產。

為了達到上述目的，本發明提供了一種利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，該方法包含：步驟1，合成胸腺素α-1基因片段；步驟2，利用核酸內切酶、連接酶將合成的胸腺素α-1基因片段融合入純化標簽基因和內含肽基因中，獲得融合蛋白重組基因，并導入宿主細胞中進行表達；步驟3，發酵該宿主細胞，使其表達目的融合蛋白，從而獲得包含胸腺素、純化標簽和內含肽的融合蛋白產物；步驟4，利用所述的純化標簽對步驟3所得的融合蛋白產物進行純化，得到純化后的融合蛋白；步驟5，利用內含肽的自剪切效應對步驟4所述純化后的融合蛋白進行裂解，獲得胸腺素28肽單體；步驟6，加入乙酰化試劑對步驟5所述的胸腺素28肽單體的N末端進行乙?；揎?，獲得天然結構的胸腺素α-1；步驟7，純化所得的天然結構胸腺素α-1。

上述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其中，所述的純化標簽包含組氨酸標簽His-tag、幾丁質結合域CBD等。用基因工程的方法來表達蛋白質，必須經過純化才能實現最終目的，將目的蛋白和一個親和純化短標簽進行融合表達，通過親和純化標簽蛋白來純化目的蛋白是常用的間接手段，當融合蛋白溶液流經親和純化介質時，融合蛋白由于純化標簽的存在會被特異親和吸附，雜質被洗掉后再洗脫目標蛋白，即達到使目的蛋白純化的目的。

上述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其中，步驟1所述的胸腺素α-1基因為GeneBank公用數據庫公布的人胸腺素α-1?28肽的基因序列。

上述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其中，步驟1所述的胸腺素α-1基因是向上海生工、英濰捷基等基因合成公司訂制合成的。