[發明專利]一種利用內含肽制備胸腺素多肽的方法

有效

• 申請號: 201210106698.6
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102676534A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 周亮;祝君;洪亮
• 申請（專利權）人: 上海育臣生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N15/16
• 分類號: C12N15/16;C12N15/62;C07K14/575;C07K1/22;C07K1/20
• 代理公司: 上海信好專利代理事務所(普通合伙) 31249
• 代理人: 賈慧琴

1.一種利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，該方法包含：

步驟1，合成胸腺素α-1基因片段；

步驟2，利用核酸內切酶、連接酶將合成的胸腺素α-1基因片段融合入純化標簽基因和內含肽基因中，獲得融合蛋白重組基因，并導入宿主細胞中進行表達；

步驟3，發酵該宿主細胞，使其表達目的融合蛋白從而獲得胸腺素融合蛋白；

步驟4，利用所述的純化標簽對步驟3所得的融合蛋白進行純化，得到純化后的融合蛋白；

步驟5，利用內含肽的自剪切效應對步驟4所述純化后的融合蛋白進行裂解，獲得胸腺素28肽單體；

步驟6，加入乙酰化試劑對步驟5所述的胸腺素28肽單體的N末端進行乙酰化修飾，獲得天然結構的胸腺素α-1；

步驟7，純化所得的天然結構胸腺素α-1。

2.如權利要求1所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，所述的純化標簽包含組氨酸標簽、幾丁質結合域。

3.如權利要求1或2所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，所述的步驟2中構建的融合蛋白重組基因的排列方式為純化標簽-內含肽-胸腺素或胸腺素-內含肽-純化標簽；所述的純化標簽、內含肽、胸腺素之間的連接方式為直接連接或借助蛋白連接肽連接。

4.如權利要求3所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟2所述的表達包含直接表達以及與其他蛋白融合表達。

5.如權利要求4所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟2所述的宿主細胞，包含原核生物宿主細胞，以及酵母、真菌和其他真核生物宿主細胞。

6.如權利要求5所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟3所述的發酵宿主細胞，是指在發酵罐中接種步驟2所述的宿主細胞，進行發酵培養使其表達目的融合蛋白；所述的步驟3還包含步驟3.1，在發酵培養結束后離心發酵液收集宿主細胞，并用緩沖液將其重懸，超聲破碎或者高壓勻漿破碎宿主細胞，離心去除不溶物，得到上清液即融合蛋白溶液。

7.如權利要求1所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟4所述的對融合蛋白進行純化，是指將融合蛋白通過親和層析柱，經緩沖液洗滌去除雜質蛋白，再通過洗脫緩沖液洗脫出目的融合蛋白。

8.如權利要求1所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟5所述的融合蛋白裂解獲得胸腺素28肽單體，是指在pH值為5-7、溫度為4℃-37℃條件下，內含肽發生剪切反應將胸腺素從融合蛋白中剪切下來，然后將所得的蛋白溶液通過親和層析柱，分離得到胸腺素28肽單體。

9.如權利要求1所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟6所述的乙酰化試劑包含乙酰氯、乙酸酐以及羥基琥珀酰亞胺乙酸酯。

10.如權利要求1所述的利用內含肽制備胸腺素多肽的方法，其特征在于，步驟7所述的純化所得的天然結構胸腺素α-1，包含利用反相高效液相層析的方法進行純化。