[發明專利]發熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒及方法

有效

• 申請號: 201210106183.6
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102618669A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 李兵;黃尉初;劉元東;車吉泊;靳曉紅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍濟南軍區聯勤部疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.發熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括以下組分：

(1)10X擴增檢測反應液：擴增檢測反應液由水、200mmol/L?Tris-HCl、100mmol/L?KCl、80mmol/L?MgSO₄、100mmol/L(NH₄)₂SO₄和8mol/L?Betaine組成；

(2)25mmol/l?dNTP；

(3)擴增檢測用引物組：為S片段特異性引物組、L片段特異性引物組或M片段特異性引物組，其中，

S片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環引物組成，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6所示；

L片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環引物組成，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7～12所示；

M片段特異性引物組由F3/B3外引物、FIP/BIP內引物和LF/LB環引物組成，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.13～18所示；

(4)Bst?DNA聚合酶：8U/μl；

(5)反轉錄酶：avian?myeloblastrosis?virus?reverse?transcriptase?100U/μl；

(6)熒光染料：1/1000?SYBR?GREEN?I或HNB?dye；

(7)ddH₂O。

2.根據權利要求1所述的發熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒，其特征在于：所述各組分構成一個反應體系，其用量為：

(1)10X擴增反應液：2.5μl；

(2)25mmol/l?dNTP：2μl；

(3)F3/B3外引物：各5pmol；

FIP/BIP內引物：各40pmol；

LF/LB環引物：各20pmol；

(4)Bst?DNA聚合酶：1μl；

(5)反轉錄酶：1μl；

(6)熒光染料：1μl；

(7)ddH₂O：補足反應體積到20μl。

3.權利要求1或2所述的發熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒在特異性檢測布尼亞病毒中的應用。

4.權利要求1或2所述的發熱伴血小板減少綜合癥布尼亞病毒環SFTSV介導等溫擴增快速檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：步驟如下：

(1)以常規RNA提取方法從待檢測者血清標本中提取RNA溶液，提取的RNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀應在1.6～2.0范圍內，濃度在10～100ng/μl范圍內；

(2)按照試劑盒的配方組成，在冰上，組合成20μl反應體系，然后取上述提取的RNA溶液5μl加入該反應體系中；

(3)上述反應體系置于63℃水浴中恒溫反應40±2min；

(4)將水浴溫度調整到80℃～85℃，保持3min，使擴增反應終止；

(5)擴增結果的判讀：上述擴增反應終止后，觀察反應體系的顏色，進行以下判斷：

①可見光目視觀察：在可見光下觀察，若反應體系的顏色變成略混濁的亮綠色，則是陽性；若反應體系的顏色不變，仍保持清澈透明的暗黃色，則為陰性；

或：②紫外線輔助觀察：在透射紫外線輔助照射下觀察，若反應體系被紫外線激發出明亮的綠色熒光，則是陽性，若反應體系不發出熒光，仍保持清澈透明的暗黃色，則為陰性；

(6)根據以上判斷結果，若判斷結果為陽性，則證明待檢測者血清標本中含有濃度大于10copy/μl的SFTSV病毒S/L/M片段；若檢測結果為陰性，則證明待測血清標本中不含有SFTSV病毒或SFTSV病毒的濃度低于10copy/μl的水平。