[發明專利]一種基于鋅指蛋白插入載體的隨機鋅指蛋白庫的構建方法

有效

• 申請號: 201210106175.1
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102634535A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 王小海;楊力俠;郭澤坤;張涌
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/11;C40B50/06
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于鋅指蛋白庫技術領域，涉及一種基于鋅指蛋白插入載體的隨機鋅指蛋白庫的構建方法。

背景技術

鋅指類蛋白廣泛分布動植物和微生物中，其中人類基因組中就有將近1％的序列編碼鋅指結構的蛋白，鋅指蛋白的共同特征是蛋白質通過與Zn²⁺的結合，使自身折疊成指狀多肽結構。根據Cys(C)和His(H)殘基的數目和位置不同，鋅指蛋白可分為CCHH、CCCH-CCCC、CCHC、CCCH等亞類。

C₂H₂鋅指結構域于1983年在非洲爪蟾卵母細胞的轉錄因子TFIIIA中被發現，是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白。這種鋅指蛋白由大約30個氨基酸殘基組成ββα的結構，每個鋅指結合3個連續的核苷酸序列。其結構比較固定并且親和力強，所以非常適合設計人工DNA結合蛋白。

目前在ZiFDB(http://bindr.gdcb.iastate.edu：8080/ZiFDB/)數據庫中有888種鋅指，主要包括四類：

SangamoBioSciences：他們設計一類三聯體鋅指蛋白，其中每個鋅指都識別GNN核苷酸序列。

Barbas?laboratory：他們采用模塊組裝的方法設計了大量能識別不同的三聯體核苷酸序列的鋅指蛋白。

Toolgen：他們從人類基因組中編碼的鋅指蛋白中篩選獲得鋅指蛋白。

Joung?laboratory：他們采用OPEN的方法創造了大量三聯體鋅指蛋白，其識別9bp的靶序列。

獲得人工聯體鋅指的方法可分為兩類：篩選法和模塊組裝法。模塊組裝法的優點在于簡易快速：簡單將各鋅指模塊連接用于識別目標序列。缺點在于設計出的聯體鋅指親和力較低或者沒有親和力。隨著鋅指結合DNA機制深入研究，該方法將會成為一種高效的方法；篩選法可信度較高，但比模塊組裝法耗時并需要較高分子實驗技能。

發明說明

本發明解決的問題在于提供一種基于鋅指蛋白插入載體的隨機鋅指蛋白庫的構建方法，通過構建將具有簡并性的隨機鋅指蛋白表達序列插入到表達載體中進行轉化，得到了高容量的隨機鋅指蛋白庫，為鋅指蛋白的篩選奠定了基礎。

本發明通過以下技術方案來實現：

一種鋅指蛋白插入載體，包括啟動子和抗生素篩選基因，在啟動子的下游含有Gal11p基因序列，在Gal11p基因序列的下游含有鋅指蛋白序列插入位點。

所述的啟動子為Lac-UV5啟動子；所述的鋅指蛋白序列插入位點的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

所述的鋅指蛋白插入載體為pBD-P-Gal11p-ZFR，通過酶切位點將lac-UV5啟動子克隆到載體pBD，然后將Gal11p基因序列克隆到lac-UV5啟動子的下游，再將鋅指蛋白序列的插入位點ZFR克隆到Gal11p基因序列的下游。

所示的Lac-UV5啟動子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；Gal11p基因序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；鋅指蛋白序列插入位點的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

一種隨機鋅指蛋白序列，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

一種隨機鋅指蛋白表達載體，是將具有粘性末端的如SEQ.ID.NO.4所示的隨機鋅指蛋白序列插入到pBD-P-Gal11p-ZFR載體的鋅指蛋白序列的插入位點ZFR中；

所述的pBD-P-Gal11p-ZFR載體，是通過酶切位點將Lac-UV5啟動子克隆入載體pBD，然后將Gal11p基因序列克隆到Lac-UV5啟動子的下游，再將鋅指蛋白序列的插入位點ZFR克隆到Gal11p基因序列的下游而構成。

一種隨機鋅指蛋白庫的構建方法，包括以下步驟：

1)分別克隆Lac-UV5啟動子元件、Gal11p基因序列和SEQ.ID.NO.3所示的鋅指蛋白序列的插入位點ZFR，然后按照Lac-UV5-gal11p-ZFR的順序將3個序列克隆到pBD載體中，構建pBD-P-Gal11p-ZFR載體；

2)根據鋅指蛋白的-1，1，2，3，5，6位點設計隨機引物，通過重疊PCR獲得如SEQ.ID.NO.4所示的隨機鋅指蛋白序列；

3)將SEQ.ID.NO.4所示的隨機鋅指蛋白序列酶切后插入到pBD-P-Gal11p-ZFR載體的鋅指蛋白序列的插入位點ZFR中，得到pBD-P-Gal11p-ZFS表達載體；