[發(fā)明專利]一種基于鋅指蛋白插入載體的隨機(jī)鋅指蛋白庫(kù)的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210106175.1
• 申請(qǐng)日: 2012-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN102634535A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王小海;楊力俠;郭澤坤;張涌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué);楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/11;C40B50/06
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬(wàn)壽

1.一種鋅指蛋白插入載體，其特征在于，包括啟動(dòng)子和抗生素篩選基因，在啟動(dòng)子的下游含有Gal11p基因序列，在Gal11p基因序列的下游含有鋅指蛋白序列插入位點(diǎn)。

2.如權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白插入載體，其特征在于，所述的啟動(dòng)子為L(zhǎng)ac-UV5啟動(dòng)子，所述的鋅指蛋白序列插入位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

3.如權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白插入載體，其特征在于，所述的鋅指蛋白插入載體為pBD-P-Gal11p-ZFR，通過(guò)酶切位點(diǎn)將lac-UV5啟動(dòng)子克隆入載體pBD，然后將Gal11P基因序列克隆到lac-UV5啟動(dòng)子的下游，再將鋅指蛋白序列的插入位點(diǎn)ZFR克隆到Gal11p基因序列的下游。

4.如權(quán)利要求3所述的鋅指蛋白插入載體，其特征在于，所示的lac-UV5啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；Gal11P基因序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；鋅指蛋白序列插入位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

5.一種隨機(jī)鋅指蛋白序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

6.一種隨機(jī)鋅指蛋白表達(dá)載體，其特征在于，是將帶有粘性末端的如SEQ.ID.NO.4所示的隨機(jī)鋅指蛋白序列插入到pBD-P-Gal11p-ZFR載體的鋅指蛋白序列的插入位點(diǎn)ZFR中；

所述的pBD-P-Gal11p-ZFR載體，是通過(guò)酶切位點(diǎn)將lac-UV5啟動(dòng)子克隆入載體pBD，然后將Gal11p基因序列克隆到Lac-UV5啟動(dòng)子的下游，再將鋅指蛋白序列的插入位點(diǎn)ZFR克隆到Gal11p基因序列的下游而構(gòu)成。

7.一種隨機(jī)鋅指蛋白庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)分別克隆lac-UV5啟動(dòng)子元件、Gal11p基因序列和SEQ.ID.NO.3所示的鋅指蛋白序列的插入位點(diǎn)ZFR，然后按照l(shuí)ac-UV5-gal11p-ZFR的順序?qū)?個(gè)序列克隆到pBD載體中，構(gòu)建pBD-P-Gal11p-ZFR載體；

2)根據(jù)鋅指蛋白的-1，1，2，3，5，6位點(diǎn)設(shè)計(jì)隨機(jī)引物，通過(guò)重疊PCR獲得如SEQ.ID.NO.4所示的隨機(jī)鋅指蛋白序列；

3)將SEQ.ID.NO.4所示的隨機(jī)鋅指蛋白序列酶切后插入到pBD-P-Gal11p-ZFR載體的鋅指蛋白序列的插入位點(diǎn)ZFR中，得到pBD-P-Gal11p-ZFS表達(dá)載體；

4)以E.coli?DH5a為宿主菌，將pBD-P-Gal11p-ZFS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌中，收集經(jīng)過(guò)氯霉素抗性篩選后的所有單克隆，提取質(zhì)粒，將得到的所有質(zhì)粒混勻，得到隨機(jī)鋅指蛋白庫(kù)。

8.如權(quán)利要求7所述的隨機(jī)鋅指蛋白庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的粘性末端的酶切是對(duì)隨機(jī)鋅指蛋白序列用pfu?DNApolymerase內(nèi)切活性進(jìn)行酶切。

9.如權(quán)利要求7所述的隨機(jī)鋅指蛋白庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的隨機(jī)鋅指蛋白序列通過(guò)BbsI酶切位點(diǎn)插入到pBD-P-Gal11p-ZFR載體中。

10.如權(quán)利要求7所述的隨機(jī)鋅指蛋白庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的pBD-P-Gal11p-ZFS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化是采用電轉(zhuǎn)化的方法，電轉(zhuǎn)化條件為電壓1800V，持續(xù)時(shí)間5ms。