[發明專利]一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201210105955.4
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN103376313A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 梁春;賀治青;王麗妍;吳宗貴;伍鋒;楊陽;俞誠虹;岳溫恒
• 申請（專利權）人: 梁春;賀治青;吳宗貴
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司 31128
• 代理人: 李浩東

技術領域

本發明涉及體外試劑盒的技術領域，具體地說是一種體外對急性冠脈綜合征患者危險分層的試劑盒，特別是涉及基于血清外來體，即exosomes的液相芯片聯合并行檢測方法及試劑盒及其制備方法。

背景技術

動脈粥樣硬化（atherosclerosis,?AS）性血管疾病已成為威脅國人健康的頭號殺手，隨著我國經濟的發展，發病率呈逐年上升趨勢，我國每年用于該類疾病的醫療費用高達千億元人民幣，加強AS性血管疾病及其并發癥的防治已成為我國重大疾病防治的主要任務。

AS性血管疾病引發的急性冠脈綜合征（Acute?coronary?syndrome,?ACS）是臨床最常見和最嚴重的表現，而冠脈易損斑塊破裂繼發血栓形成是其發生的最主要病理基礎。目前作為冠心病診斷“金標準”的冠狀動脈造影并不能很好的識別易損斑塊，易損斑塊的識別和診斷主要依賴于血管內超聲及血管鏡等介入影像學手段，可以顯示血管壁的病變，精確地區別病變的性質來識別易損斑塊，但卻不能檢測斑塊中的炎癥活性，更由于其為有創性檢查，技術條件要求高且費用較昂貴，限制了它的推廣應用。因此，尋找能反映AS易損斑塊敏感而特異性的血清學標志物，并通過有效干預，在易損斑塊破裂前，早期將其識別并使之趨向穩定，有望達到減少ACS發生的目的。

Exosomes即外來體，是一類大小介于10-100nm之間具有脂質雙層膜結構的生物囊泡結構，其主要是細胞在被刺激后大量分泌，通過多囊泡小體胞吐到細胞外，最早發現其主要來源于血小板，具有促凝的作用，后來大量研究證實：除外血小板，內皮細胞、血管平滑肌細胞、白細胞、淋巴細胞、紅細胞等均能釋放exosomes。近年來的研究證實不同疾病患者血清中的exosomes分泌異常增高，且其用于診斷和預測的特異性明顯高于血清標志物，可以作為一種疾病危險分層的指標。

但現有的診斷試劑盒多集中于借助外周血清標志物提高對ACS的診斷敏感性和特異性方面，在改善患者的危險分層方面的相關試劑盒還是一個空白，同時相關試劑盒的特異性不高，而這方面恰恰是目前臨床患者管理所急需的。

目前，對于exosomes標志物的測定主要依賴流式細胞分析，但流式細胞分析一次只能針對一個標志物進行檢測，且操作繁瑣、敏感度各異，不能真正滿足臨床的需要，此外由于上述exosomes標志物在ACS的病程中有不同的表達，上述問題使得各個指標在ACS患者的危險分層和預后判斷中的價值各異，若能同時檢測，則能大幅度提高ACS患者危險分層和預后判斷的準確度。而固相生物芯片技術存在著重復性差、敏感度不高及操作繁瑣的缺點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種改進的基于血清外來體檢測急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒及其制備方法，它可克服現有技術中在改善患者的危險分層方面的相關試劑盒還是一個空白，同時相關試劑盒的特異性不高的一些不足。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒，它主要包括，其特征在于：?

所述的液相芯片試劑盒包括有以下組分：

1）包被微球：微球主要包括兩類，一種直徑為5.6μm的聚苯乙烯微球，另一種為直徑為6.5μm的磁性微球，上述兩類微球分別包被了CD11c捕獲抗體的微球、包被了CD81捕獲抗體的微球、包被了MHCⅡ捕獲抗體的微球、包被了CD86捕獲抗體的微球、包被了CD106捕獲抗體的微球、包被了CD54?捕獲抗體的微球和包被了CD3捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；

2）生物素標記檢測抗體：含有分別用生物素標記的CD11c、CD81、MHCⅡ、CD86、CD106、CD54?和CD3檢測抗體；

3）鏈親合素藻紅蛋白。

一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包括如下步驟：?

1）??????????????按照試劑盒的組成，制備抗體包被微球，每種捕獲抗體包被微球的制備方法相同：

將50ul微球活化后，經過高速離心沉淀，離心條件為≥7500g，5分鐘；

吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μl的50mM的MES溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲25-30秒，后將微球離心，離心條件為≥8000g，離心1-2分鐘；重復上述步驟；

吸棄上清，將微球重懸于100μl?50mM?pH5.0的MES的溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲25-30秒；