[發(fā)明專利]一種基于血清外來體檢測(cè)急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210105955.4
• 申請(qǐng)日: 2012-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN103376313A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁春;賀治青;王麗妍;吳宗貴;伍鋒;楊陽(yáng);俞誠(chéng)虹;岳溫恒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 梁春;賀治青;吳宗貴
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543
• 代理公司: 上海世貿(mào)專利代理有限責(zé)任公司 31128
• 代理人: 李浩東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外試劑盒的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種體外對(duì)急性冠脈綜合征患者危險(xiǎn)分層的試劑盒，特別是涉及基于血清外來體，即exosomes的液相芯片聯(lián)合并行檢測(cè)方法及試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis,?AS）性血管疾病已成為威脅國(guó)人健康的頭號(hào)殺手，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，我國(guó)每年用于該類疾病的醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)千億元人民幣，加強(qiáng)AS性血管疾病及其并發(fā)癥的防治已成為我國(guó)重大疾病防治的主要任務(wù)。

AS性血管疾病引發(fā)的急性冠脈綜合征（Acute?coronary?syndrome,?ACS）是臨床最常見和最嚴(yán)重的表現(xiàn)，而冠脈易損斑塊破裂繼發(fā)血栓形成是其發(fā)生的最主要病理基礎(chǔ)。目前作為冠心病診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的冠狀動(dòng)脈造影并不能很好的識(shí)別易損斑塊，易損斑塊的識(shí)別和診斷主要依賴于血管內(nèi)超聲及血管鏡等介入影像學(xué)手段，可以顯示血管壁的病變，精確地區(qū)別病變的性質(zhì)來識(shí)別易損斑塊，但卻不能檢測(cè)斑塊中的炎癥活性，更由于其為有創(chuàng)性檢查，技術(shù)條件要求高且費(fèi)用較昂貴，限制了它的推廣應(yīng)用。因此，尋找能反映AS易損斑塊敏感而特異性的血清學(xué)標(biāo)志物，并通過有效干預(yù)，在易損斑塊破裂前，早期將其識(shí)別并使之趨向穩(wěn)定，有望達(dá)到減少ACS發(fā)生的目的。

Exosomes即外來體，是一類大小介于10-100nm之間具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的生物囊泡結(jié)構(gòu)，其主要是細(xì)胞在被刺激后大量分泌，通過多囊泡小體胞吐到細(xì)胞外，最早發(fā)現(xiàn)其主要來源于血小板，具有促凝的作用，后來大量研究證實(shí)：除外血小板，內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞等均能釋放exosomes。近年來的研究證實(shí)不同疾病患者血清中的exosomes分泌異常增高，且其用于診斷和預(yù)測(cè)的特異性明顯高于血清標(biāo)志物，可以作為一種疾病危險(xiǎn)分層的指標(biāo)。

但現(xiàn)有的診斷試劑盒多集中于借助外周血清標(biāo)志物提高對(duì)ACS的診斷敏感性和特異性方面，在改善患者的危險(xiǎn)分層方面的相關(guān)試劑盒還是一個(gè)空白，同時(shí)相關(guān)試劑盒的特異性不高，而這方面恰恰是目前臨床患者管理所急需的。

目前，對(duì)于exosomes標(biāo)志物的測(cè)定主要依賴流式細(xì)胞分析，但流式細(xì)胞分析一次只能針對(duì)一個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，且操作繁瑣、敏感度各異，不能真正滿足臨床的需要，此外由于上述exosomes標(biāo)志物在ACS的病程中有不同的表達(dá)，上述問題使得各個(gè)指標(biāo)在ACS患者的危險(xiǎn)分層和預(yù)后判斷中的價(jià)值各異，若能同時(shí)檢測(cè)，則能大幅度提高ACS患者危險(xiǎn)分層和預(yù)后判斷的準(zhǔn)確度。而固相生物芯片技術(shù)存在著重復(fù)性差、敏感度不高及操作繁瑣的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的基于血清外來體檢測(cè)急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒及其制備方法，它可克服現(xiàn)有技術(shù)中在改善患者的危險(xiǎn)分層方面的相關(guān)試劑盒還是一個(gè)空白，同時(shí)相關(guān)試劑盒的特異性不高的一些不足。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種基于血清外來體檢測(cè)急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒，它主要包括，其特征在于：?

所述的液相芯片試劑盒包括有以下組分：

1）包被微球：微球主要包括兩類，一種直徑為5.6μm的聚苯乙烯微球，另一種為直徑為6.5μm的磁性微球，上述兩類微球分別包被了CD11c捕獲抗體的微球、包被了CD81捕獲抗體的微球、包被了MHCⅡ捕獲抗體的微球、包被了CD86捕獲抗體的微球、包被了CD106捕獲抗體的微球、包被了CD54?捕獲抗體的微球和包被了CD3捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；

2）生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體：含有分別用生物素標(biāo)記的CD11c、CD81、MHCⅡ、CD86、CD106、CD54?和CD3檢測(cè)抗體；

3）鏈親合素藻紅蛋白。

一種基于血清外來體檢測(cè)急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包括如下步驟：?

1）??????????????按照試劑盒的組成，制備抗體包被微球，每種捕獲抗體包被微球的制備方法相同：

將50ul微球活化后，經(jīng)過高速離心沉淀，離心條件為≥7500g，5分鐘；

吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μl的50mM的MES溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲25-30秒，后將微球離心，離心條件為≥8000g，離心1-2分鐘；重復(fù)上述步驟；

吸棄上清，將微球重懸于100μl?50mM?pH5.0的MES的溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲25-30秒；