[發(fā)明專利]一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合征的液相芯片試劑盒及其制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210105955.4 | 申請日： | 2012-04-12 |
| 公開（公告）號： | CN103376313A | 公開（公告）日： | 2013-10-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 梁春;賀治青;王麗妍;吳宗貴;伍鋒;楊陽;俞誠虹;岳溫恒 | 申請（專利權(quán)）人： | 梁春;賀治青;吳宗貴 |
| 主分類號： | G01N33/543 | 分類號： | G01N33/543 |
| 代理公司： | 上海世貿(mào)專利代理有限責(zé)任公司 31128 | 代理人： | 李浩東 |
| 地址： | 200433 上海市楊浦區(qū)中*** | 國省代碼： | 上海;31 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 血清 外來 體檢 急性 綜合征 芯片 試劑盒 及其 制備 方法 | ||
1.一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合癥的液相芯片試劑盒，它主要包括，其特征在于：?所述的液相芯片試劑盒包括有以下組分：
1）包被微球：微球主要包括兩類，一種直徑為5.6μm的聚苯乙烯微球，另一種為直徑為6.5μm的磁性微球，上述兩類微球分別包被了CD11c捕獲抗體的微球、包被了CD81捕獲抗體的微球、包被了MHCⅡ捕獲抗體的微球、包被了CD86捕獲抗體的微球、包被了CD106捕獲抗體的微球、包被了CD54?捕獲抗體的微球和包被了CD3捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；
2）生物素標(biāo)記檢測抗體：含有分別用生物素標(biāo)記的CD11c、CD81、MHCⅡ、CD86、CD106、CD54?和CD3檢測抗體；
3）鏈親合素藻紅蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合癥的液相芯片試劑盒，其特征在于：每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為120-130個/μl；每種生物素標(biāo)記檢測抗體的使用濃度為1-4μg/ml。?
3.一種基于血清外來體檢測急性冠脈綜合癥的液相芯片試劑盒的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包括如下步驟：
1）?????????按照試劑盒的組成，制備抗體包被微球，每種捕獲抗體包被微球的制備方法相同：
將50ul微球活化后，經(jīng)過高速離心沉淀，離心條件為≥7500g，5分鐘；
吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μl的50mM的MES溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲25-30秒，后將微球離心，離心條件為≥8000g，離心1-2分鐘；重復(fù)上述步驟；
吸棄上清，將微球重懸于100μl?50mM?pH5.0的MES的溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲25-30秒；
往懸浮的微球中加入相應(yīng)的0.8-1.2μg抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補(bǔ)至450-550μl；
用渦旋振蕩器混勻，室溫避光振蕩2-2.5小時；
將偶聯(lián)好抗體的微球離心沉淀，離心條件為≥8000g，離心1-2分鐘；
吸棄上清，將微球重懸于500μl?PBS-TBN溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲振蕩25-30秒；
室溫避光振蕩30分鐘；再離心收集微球，離心條件為≥8000g，離心1-2分鐘；
吸棄上清，將微球重懸于1ml?的PBS-TBN溶液中，渦旋振蕩25-30秒，超聲振蕩25-30秒；離心收集微球，離心條件為≥8000g，離心1-2分鐘；重復(fù)該步驟一次；
吸棄上清，將微球重懸于500-1000μl?的PBS-TBN溶液中；
每種包被好的微球通過Luminex儀器計數(shù)后置于2-8度避光單獨(dú)保存，使用時，依據(jù)監(jiān)測需要等比例混合，混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)微球的濃度均為125個/μl；
2）?????????按照試劑盒的組成，進(jìn)行每種檢測抗體的生物素標(biāo)記：
依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至1mg/ml的體積，該體積作為目標(biāo)體積；
用二甲亞砜溶液，配置10mg/ml的N-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素反應(yīng)液；
按摩爾比1:100于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與N-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素反應(yīng)液；
加入體積為目標(biāo)體積1/10的pH8.9的碳酸氫鈉溶液，隨后加入pH7.4的PBS補(bǔ)至目標(biāo)體積；
包上鋁箔或放入避光暗盒中，將反應(yīng)管或避光暗盒置于圓周振蕩搖床上，于25度恒溫箱中避光孵育4-5小時，轉(zhuǎn)速為900rpm-1000rpm；
將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液透析過夜，以去除未反應(yīng)的N-羥基硫代琥珀酰亞胺生物素反應(yīng)液；
使用時根據(jù)需要將標(biāo)記好的每種檢測抗體等比例混合；
3）?????????具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的生物囊泡結(jié)構(gòu)的抽提：
可以采用超速離心、超濾或者商品化的專用抽提試劑從固定量血清中抽提膜性小囊泡，并進(jìn)行蛋白定量完成樣品的標(biāo)準(zhǔn)化，制備成待測樣品，所述的固定量血清體積大于等于1ml。
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