[發(fā)明專(zhuān)利]基于物理化學(xué)相結(jié)合的新型多糖硫酸化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210105252.1
• 申請(qǐng)日: 2012-04-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102659955A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李衛(wèi)旗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C08B37/00
• 分類(lèi)號(hào): C08B37/00;A61P39/06;G01N21/35;G01N21/78;G01N31/22
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多糖化學(xué)改性方面的工藝，具體的說(shuō)是基于物理化學(xué)相結(jié)合的新型多糖硫酸化方法。

技術(shù)背景

從藥用真菌中提取的多糖具有多種生物活性，特別是免疫刺激和抗腫瘤的功能，使其成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。這種生物大分子不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接毒害作用，而是通過(guò)作用于防御和免疫系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮作用。

通常有四個(gè)因素影響多糖的生物活性：分別為水溶解性，分子量，分子鏈結(jié)構(gòu)和取代基團(tuán)。通過(guò)化學(xué)改性的手段可以使多糖獲得新的生物學(xué)活性從而開(kāi)發(fā)新的藥用領(lǐng)域。

多糖是由單糖殘基通過(guò)糖苷鍵相連的聚合體，相對(duì)于其它生物大分子，其具有承載更多生物信息的能力。多糖的活性直接或間接地受其分子結(jié)構(gòu)的影響，采取一定的方法對(duì)多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，可以提高或賦予多糖活性、降低其毒副作用。目前對(duì)多糖進(jìn)行修飾的常見(jiàn)方法有硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、磺酰化、羧甲基化等。這些改性方法不僅改變了多糖的理化性質(zhì)，還能改變其生理活性。

直到二十世紀(jì)七十年代，多糖的硫酸化活性才被認(rèn)識(shí)，然而在當(dāng)今，硫酸化是改變多糖生物學(xué)活性最主要，也是最有效的手段。國(guó)外有研究表明硫酸化的香菇多糖對(duì)HIV病毒有抑制作用。多糖中的硫酸基慢慢的增加，免疫活性逐漸變小，當(dāng)硫酸基的量增加到某一值時(shí)，免疫活性完全消失，轉(zhuǎn)變?yōu)榭共《净钚浴?/p>

通常硫酸化改性方法，是使用一些硫酸化試劑，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，在多糖的單元羥基上連上硫酸基團(tuán)。常用的硫酸化體系有：氯磺酸——吡啶，三氧化硫——三乙胺，濃硫酸。而反應(yīng)是通過(guò)直接加熱的手段來(lái)完成硫酸化的過(guò)程。一些研究表明，溫度越高，硫酸化的取代度越高，然而過(guò)高的溫度會(huì)影響分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失。因此只能在溫和的溫度下，通過(guò)延長(zhǎng)反應(yīng)的時(shí)間，來(lái)達(dá)到硫酸化高取代度的目的，現(xiàn)在一般的硫酸化反應(yīng)都要經(jīng)過(guò)8-10小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，才能達(dá)到理想的硫酸化程度。

微波可以對(duì)介質(zhì)材料瞬時(shí)加熱升溫，能耗也很低。另一方面，微波的輸出功率隨時(shí)可調(diào)，介質(zhì)溫升可無(wú)惰性的隨之改變，不存在“余熱”現(xiàn)象，極有利于自動(dòng)控制和連續(xù)化生產(chǎn)的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種采用化學(xué)物理結(jié)合的手段進(jìn)行多糖硫酸化生產(chǎn)的工藝，這種工藝可以達(dá)到傳統(tǒng)工藝的硫酸化程度，而且保持了較高的生物學(xué)活性，同時(shí)大大縮短了硫酸化的時(shí)間。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：按以下步驟進(jìn)行：

1、以香菇多糖作為參與反應(yīng)的底物，香菇胞外多糖通過(guò)氣升式發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液中提取，純化而獲得的均一純品多糖。

2、硫酸化試劑的制備：采用取代率較高的硫酸化體系——氯磺酸-吡啶體系：將氯磺酸緩慢滴加到裝有吡啶的容器中，滴加過(guò)程應(yīng)在冰鹽浴中進(jìn)行，并用磁力攪拌器攪拌，控制溫度在0攝氏度至4攝氏度以防過(guò)熱。

3、微波輔助法

將純品多糖溶解在甲酰胺中，硫酸化試劑緩慢滴加，攪拌均勻。利用微波爐進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，混合液調(diào)節(jié)至pH中性，并用酒精沉淀，離心復(fù)溶于水，濃縮透析，凍干，獲得硫酸化產(chǎn)品。

4、紅外檢測(cè)

KBr壓片法傅立葉紅外光譜儀檢測(cè)，400-4000cm^-1觀察硫酸取代的特殊峰。

5、SD檢測(cè)

碳水化合物含量的檢測(cè)采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的檢測(cè)采用氯化鋇明膠法。

6、體外抗氧化活性的檢測(cè)。超氧根自由基清除能力：

模擬黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質(zhì)和griess顯色劑，在550nm比色。測(cè)試管中加入不同濃度的樣品，計(jì)算樣品的超氧陰離子清除能力。

氫氧根自由基清除能力：利用fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，給與電子受體后，用griess顯色，550nm比色，測(cè)試管中加入不同濃度的樣品，計(jì)算樣品的羥基陰離子清除能力。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：微波輔助法相對(duì)于傳統(tǒng)方法，耗時(shí)更短。傳統(tǒng)方法需要10小時(shí)左右，而新工藝只需要短短6分鐘就完成反應(yīng)。利用微波的特性，即達(dá)到加熱的目的，采用間歇處理的手段防止過(guò)度加熱導(dǎo)致的失活。同時(shí)由于微波的特點(diǎn)，使得分子在溶劑中充分舒展，更好的與硫酸化試劑接觸。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，新工藝獲得的樣品同樣達(dá)到了硫酸化的結(jié)果，其取代率高，同時(shí)未失去生物活性。

附圖說(shuō)明

圖1為KBr壓片法傅立葉紅外光譜儀檢測(cè)對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明結(jié)合具體例通過(guò)以下步驟進(jìn)行：