[發明專利]一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法

無效

• 申請號: 201210105195.7
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102628083A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 鄒曙明;田玉梅;蔣霞云
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 金重慶

技術領域

本發明涉及魚類基因工程領域，具體地說，是一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法，及其在金魚Tgf2轉座子插入位點檢測中的應用，適用于在金魚和養殖魚類Tgf2轉座子介導的轉基因或插入誘變后代中進行快速準確的開展基因組插入拷貝數和側翼序列的鑒定。

背景技術

DNA轉座子(transposon)是一類能在宿主基因組中變更插入位置的可移動遺傳因子，其變更插入位置的過程稱為轉座(transposition)。很多不同的轉座子(如P因子和Mos1)介導的基因組插入誘變已被作為大規模遺傳篩選的工具，不僅在單細胞生物如細菌和酵母中，而且在多細胞生物包括蠕蟲、果蠅和擬南芥的研究中都被證明是成功的，它們為發現和解碼這些生物的性狀主控基因作出了巨大的貢獻。近年來，我們在一些金魚品系中發現了一個新的、具有天然轉座活性hAT?家族轉座子，為近年發現的第二例具有天然轉座活性的脊椎動物轉座子，根據國際轉座子的命名標準，命名該轉座子為Tgf2?轉座子。Tgf2?轉座子來源于鯉科魚類，其在鯉科養殖魚類中的轉基因整合率約為50％，是第1代線性化質粒注射方法的10倍。與昆蟲piggyBac轉座子傾向插入TTAA和Tc1/mariner轉座子家族偏好AT位點相比，鯉科?Tgf2轉座子為隨機插入，這為開辟鯉科養殖魚類全基因組插入誘變研究奠定了物質基礎。

目前，進行轉座子在生物基因組插入拷貝數和側翼序列一般采用反向PCR?(inverse?PCR)方法。反向PCR在擴增前先用限制性內切酶酶切樣品基因組DNA，再用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子，然后通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段，并進行測序，從而獲得插入拷貝數的側翼序列和拷貝數。反向PCR方法存在一些缺點和不足，例如，1、酶切、自連過程受到很多不確定因素的影響，需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段，這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA；2、為提高分子間連接的效率，連接反應中基因組DNA的濃度要低，因為高濃度的DNA可能會提高非同源連接水平，從而產生非特異擴增；3、成環的雙鏈DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反應，它只可以擴增出較短的DNA片段；4、魚類轉座子插入位點存在多拷貝，反向PCR引物可能與多個基因序列雜交，嚴重干擾轉座子插入位點側翼序列的鑒定。

中國專利文獻CN101962659A公開了一種基于Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體及其制備方法，由轉基因供體質粒和輔助質粒組成，轉基因供體質粒由魚類啟動子序列，如斑馬魚Krt8啟動子、目的基因、以及金魚Tgf2轉座子左右臂序列構建，輔助質粒由斑馬魚β-actin啟動子和金魚Tgf2轉座酶編碼基因構建，為進行魚類轉基因研究提供了新方法。中國專利文獻CN101962660A公開了一種基于Tgf2轉座子的魚類轉基因方法及其載體和載體的制備方法，通過注射轉基因供體質粒，并輔以基于Tgf2轉座酶mRNA兩種載體，共同注射入魚類1-2期細胞期受精卵，即可實現高效轉基因，與常規魚類轉基因技術相比，具有整合效率高、負載容量大、通用、安全和高效的優點。但是關于一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法目前還未見報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法，所述的方法包括以下步驟：（1）通過對帶有Tgf2轉座子的金魚基因組DNA提取；（2）再對全基因組DNA進行限制性內切酶酶切；（3）酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；（4）接下來分別進行第一輪?PCR和第二輪?PCR分別擴增轉座子插入位點5'和3'側翼序列，對第二輪PCR產物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列，并推測插入的拷貝數，所述的檢測出的Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列數即為插入的拷貝數。

所述的步驟（1）中的金魚基因組DNA帶有Tgf2轉座子插入位點，包括基因組本身帶有Tgf2轉座子的金魚各品系，以及通過轉座方式插入Tgf2轉座子的其他魚類。

所述的步驟（2）中的限制性內切酶為Sau3A1，酶切好的DNA片段帶有GATC粘性末端。

所述的步驟（3）中的splinkerette接頭包含長序列SEQ?ID?No:1和短序列SEQ?ID?No:2。