[發明專利]一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法

無效

• 申請號: 201210105195.7
• 申請日: 2012-04-12
• 公開（公告）號: CN102628083A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 鄒曙明;田玉梅;蔣霞云
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 金重慶

1.一種檢測Tgf2轉座子在金魚基因組插入側翼序列和拷貝數的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：（1）通過對帶有Tgf2轉座子的金魚基因組DNA提取；（2）再對全基因組DNA進行限制性內切酶酶切；（3）酶切好的DNA片段與splinkerette接頭連接；（4）接下來分別進行第一輪?PCR和第二輪?PCR分別擴增轉座子插入位點5'和3'側翼序列，對第二輪PCR產物進行克隆和序列測定，從而檢測出Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列，并推測插入的拷貝數，所述的檢測出的Tgf2轉座子在魚類基因組側翼序列數即為插入的拷貝數。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（1）中金魚基因組DNA帶有Tgf2轉座子插入位點，包括基因組本身帶有Tgf2轉座子的金魚各品系，以及通過轉座方式插入Tgf2轉座子的其他魚類。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中限制性內切酶為Sau3A1，酶切好的DNA片段帶有GATC粘性末端。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（3）中splinkerette接頭包含長序列SEQ?ID?No:1和短序列SEQ?ID?No:2。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的splinkerette接頭的合成步驟為：把權利要求4所述的splinkerette接頭長序列與短序列等濃度等體積混合，95℃保溫5min，然后以1℃/15s逐步降至4℃，長序列與短序列退火形成splinkerette接頭。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的splinkerette接頭一側帶有段序列的GATC粘性末端，另一側帶有由于短序列中的AT堿基互補配對形成一個7bp的發卡結構而形成錯配區。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（3）中酶切好的DNA片段與splinkerette接頭均帶有GATC粘性末端，通過T4連接酶連接，形成酶切DNA片段兩端帶有splinkerette接頭的DNA片段。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（4）中進行轉座子插入位點5'側翼序列擴增的第一輪?PCR，所用引物為Splink1：SEQ?ID?No:5和Tgf2-5'GSP3:?SEQ?ID?No:3；對第一輪PCR產物稀釋50倍，并進行第二輪?PCR，所用的引物為：Splink2:?SEQ?ID?No:6和Tgf2-5'GSP4：SEQ?ID?No:4，對第二輪PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉座子在金魚基因組5'側翼序列，并推測出插入拷貝數。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟（4）中進行轉座子插入位點3'側翼序列擴增的第一輪?PCR，所用引物為：Splink1:?SEQ?ID?No:5和Tgf2-3'GSP1:?SEQ?ID?No:7；對第一輪PCR產物稀釋50倍，進行第二輪?PCR，所用的引物為：Splink2:?SEQ?ID?No:6和Tgf2-3'GSP2:?SEQ?ID?No:8，對第二輪PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，割膠回收后與T載體連接，克隆到大腸桿菌DH5α中，挑選陽性克隆進行序列雙向測定，檢測出Tgf2轉座子在金魚基因組3'側翼序列，并推測出插入拷貝數。