[發(fā)明專利]一種苯環(huán)利定人工抗原的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210104479.4
• 申請日: 2012-04-11
• 公開（公告）號: CN102627696A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵越水;林燕芳
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州培樂生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/113
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華;徐關(guān)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苯環(huán)利定人工抗原的制備方法。

背景技術(shù)

苯環(huán)利定（pHencycliding，PCP）為一種對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制、興奮、鎮(zhèn)痛和致幻作用的精神活性藥物，化學(xué)名為1-（1-苯基環(huán)己烷）哌啶，其結(jié)構(gòu)式為：

????PCP是一種解離性藥物，曾被麻醉師當(dāng)作麻醉劑使用，具有迷幻和毒害神經(jīng)的效應(yīng)。它常常被稱為天使粉，常導(dǎo)致定向障礙、激越和譫妄構(gòu)成的急性綜合征。雖然PCP的初步對神經(jīng)的作用只持續(xù)幾個小時，但完全從體內(nèi)血漿排除會延長，經(jīng)常會延續(xù)數(shù)周。PCP對神經(jīng)系統(tǒng)有潛在的作用，會改變感知功能（幻覺，錯覺，譫妄或精神混亂）、運動功能（步態(tài)蹣跚，無協(xié)調(diào)性，眼球運動混亂或眼球震顫）和植物神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)（心率過快，溫度調(diào)節(jié)改變）。PCP會以一種無法預(yù)測的方式改變?nèi)说那榫w狀態(tài)，導(dǎo)致一些人人格分離，而另一些人則變得生氣勃勃，精力旺盛。目前已被國家和國際禁毒公約列入麻醉藥品的規(guī)范中進行嚴(yán)格管制。

目前，對苯環(huán)利定的檢測主要依靠高效液相色譜法（HPLC）,氣相色譜（GC），薄層色譜（TLC），質(zhì)譜（MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費時，并且需要專業(yè)技術(shù)人員進行操作，不能達到現(xiàn)代檢測對快速，準(zhǔn)確的要求。而免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方法,?該方法的前提就是需要提供特異性的抗原和抗體。因此有必要提供一種有效的苯環(huán)利定人工抗原的制備方法,制備的苯環(huán)利定人工抗原可用于免疫制備具有特異性的苯環(huán)利定抗體,進一步用于檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷與不足，提供一種苯環(huán)利定人工抗原的制備方法，所制備的苯環(huán)利定人工抗原可進行動物免疫，取得相應(yīng)的苯環(huán)利定抗體，可用于各種苯環(huán)利定類免疫分析法的研究，為苯環(huán)利定的檢測提供更加方便快速準(zhǔn)確的途徑。

一種苯環(huán)利定人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)?制備人工半抗原：

(a)?將1-苯基環(huán)己醇與疊氮鈉、三氟乙酸以摩爾比為1：2：5.7溶于氯仿中，室溫攪拌反應(yīng)5小時；反應(yīng)結(jié)束后用濃氨水調(diào)至堿性，有機相經(jīng)雙蒸水和飽和食鹽水溶液洗滌后，減壓蒸餾得到含疊氮基化合物；TLC：層析液為正己烷：乙酸乙酯=4:1，產(chǎn)物R_f?=0.7~0.8；

(b)?將含疊氮基化合物與氫化鋁鋰以摩爾比為1：1.5溶于無水乙醚中,?冰浴反應(yīng)1小時后，再室溫攪拌反應(yīng)5小時；反應(yīng)結(jié)束后加入雙蒸水和氫氧化鈉水溶液，氯仿萃取，有機相減壓蒸餾后經(jīng)薄層層析法純化得到產(chǎn)物1-苯基環(huán)己胺；TLC：層析液為石油醚：乙酸乙酯=2:1，產(chǎn)物R_f?=0.2~0.3；

????(c)?將產(chǎn)物1-苯基環(huán)己胺與戊二酸酐以摩爾比為1：1.2溶于無水吡啶中，100℃反應(yīng)5小時；反應(yīng)結(jié)束后進行減壓蒸餾,?得到的粗產(chǎn)物經(jīng)薄層層析法純化得到苯環(huán)利定半抗原；TLC：層析液為為95%乙醇，產(chǎn)物R_f?=0.5~0.6；

????(2)?制備苯環(huán)利定人工抗原：

(d)?將半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺、環(huán)己基碳酰二亞胺以摩爾比為1:1.5:1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室溫攪拌反應(yīng)18小時，反應(yīng)結(jié)束后離心取上清液記為A液；

(e)?將氯化鈉與十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉以摩爾比為78.3:4.2:1溶于雙蒸水中，制備鈉離子濃度為0.1mol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4；

(f)?將牛血清蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為20mg/ml的B液；

(g)?將A液緩慢滴加到B液，A液與B液的體積比為1:5，得到的混合液在4℃條件下靜置保存過夜，得到人工抗原混合液；

(h)?將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，透析結(jié)束后離心取上清液即得到人工抗原：苯環(huán)利定-牛血清蛋白。

由于苯環(huán)利定的分子量較小，單獨作用時不具有免疫原性或免疫原性較弱，因此必須將其與大分子載體比如牛血清蛋白連接形成苯環(huán)利定抗原后，才能刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的苯環(huán)利定抗體。本發(fā)明在制備苯環(huán)利定人工抗原過程中，所選的位點和交聯(lián)方法都沒有明顯改變其結(jié)構(gòu)，保留了抗原決定簇。在苯環(huán)利定半抗原和牛血清蛋白之間引入橋結(jié)構(gòu)，暴露抗原決定簇，所獲得的苯環(huán)利定人工抗原保持了苯環(huán)利定的結(jié)構(gòu)特異性，有利于相應(yīng)苯環(huán)利定抗體的產(chǎn)生。