[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號核酸定量檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210104160.1
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN103361411A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王晶;隋志偉;李亮;余笑波;臧超;董蓮華
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號核酸定量檢測方法和檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及一種用于修正轉(zhuǎn)基因檢測值與真實值間的偏差方法，具體地說，是建立一種計算修正偏差的校正系數(shù)的方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號是由受體水稻秀水11轉(zhuǎn)入外源基因Cry1Ab后培育的抗蟲水稻。

有關(guān)克螟稻2號的轉(zhuǎn)基因檢測方法有如下報道：岳運鋒等發(fā)表在《中國油料作物學(xué)報》上的文章《轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因定性PCR檢測方法研究》，報道了有關(guān)克螟稻定性檢測方法。但到目前為止針對轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號的精確定量檢測方法的內(nèi)容還尚未見到。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的生物安全性以及可能對人類健康的影響引起了各國政府和民眾的普遍關(guān)注。許多國家和地區(qū)都加強了對轉(zhuǎn)基因商品的管理，出臺了對轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品實施強制性標(biāo)簽的制度，規(guī)定了食品中轉(zhuǎn)基因成分含量的最低標(biāo)識限量。

目前，克螟稻2號已被農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會定義為最安全的等級，并通過了食用安全性認證。因為克螟稻2號有可能作為食品，因此，建立克螟稻2號水稻中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測方法，特別是研究出比較精確的定量檢測方法和提供克螟稻2號水稻檢測試劑非常必要。

轉(zhuǎn)基因生物檢測首先需要提取轉(zhuǎn)基因植物的DNA。理想狀態(tài)下，轉(zhuǎn)基因植物與其受體植物的DNA提取效率應(yīng)該相同。但有些生物在插入外源基因形成轉(zhuǎn)基因生物后，會引起生物的某些特性發(fā)生變化，因此轉(zhuǎn)基因生物的基因組在提取時會受到影響，提取的外源基因DNA濃度低于其真實濃度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因成分的檢測值(即外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)分?jǐn)?shù))低于其實際值。

因此，需要研究一種在轉(zhuǎn)基因生物檢測中用于修正轉(zhuǎn)基因檢測值與真實值間的偏差方法。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種精確定量檢測轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(KMD2)及其制品的方法和檢測試劑盒，且靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確度好，精確度高。

本發(fā)明的另一目的是，建立一種用于修正轉(zhuǎn)基因檢測值與真實值間的偏差方法，具體地說，是建立一種計算修正偏差的校正系數(shù)的方法。

本發(fā)明首次建立了一種精確定量檢測轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號及其制品的方法，為了滿足轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號檢測的精確定量，要求水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴增效果和擴增效率均與外源基因克螟稻2號相同。本發(fā)明人進行了如下工作：

①選擇適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

分別合成了五種常用的水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因水稻基因GOS9、PLD、SPS、RBE4、UBQ5引物后，以提取的轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號為基礎(chǔ)，分別進行五個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因克螟稻的PCR擴增，將擴增后的PCR產(chǎn)物，進行電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBE4基因的擴增產(chǎn)物亮度最接近外源基因克螟稻2號，其余四個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因產(chǎn)物亮度都暗。

因此，確定了轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號檢測的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因為RBE4。

②得到適合兩個基因擴增的最佳條件

合成內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因RBE4和外源基因克螟稻2號的引物和探針，進行PCR體系優(yōu)化，得到適合兩個基因擴增的最佳條件。

我們對現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于轉(zhuǎn)基因該檢測方法的五個元素的配比體系上進行了優(yōu)化，得出了最佳的檢測PCR體系。

③驗證檢測方法的效果

將提取的轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號基因組DNA進行系列稀釋后作為模板，分別進行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因RBE4和外源基因克螟稻2號的熒光定量PCR擴增，將每個稀釋梯度濃度的模板所擴增的RBE4和克螟稻2號基因擴增的Ct值進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

克螟稻2號與RBE4的Ct值比值均在0.99到1之間，證明RBE4作為內(nèi)標(biāo)基因在實時熒光定量PCR檢測中具有很好的效果。

RBE4的檢測限和定量限分別為5個拷貝和15個拷貝，克螟稻2號的檢測限和定量限分別為5個拷貝和15個拷貝，證明兩個基因的檢測靈敏度都很高。

④轉(zhuǎn)基因克螟稻2號與非轉(zhuǎn)基因受體水稻核酸提取效率比較

本發(fā)明還建立了一種方法，用于修正轉(zhuǎn)基因檢測值與真實值間的偏差。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，受體水稻秀水11在插入外源基因Cry1Ab所形成的轉(zhuǎn)基因克螟稻2號的基因組在提取時會受到影響，測得的外源基因DNA濃度低于其真實濃度，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因成分的檢測值(即外源基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)分?jǐn)?shù))低于其實際值。

因此為了使檢測結(jié)果接近于真實情況，需要建立一種校正方法。

歐盟IRMM的轉(zhuǎn)基因植物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中首先要將轉(zhuǎn)基因植物與其受體植物的種子粉末的分別提取其核酸。