[發明專利]轉基因水稻克螟稻2號核酸定量檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210104160.1
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN103361411A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 王晶;隋志偉;李亮;余笑波;臧超;董蓮華
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

1.一種轉基因水稻克螟稻2號核酸定量檢測試劑盒，試劑盒中包括熒光定量PCR試劑、PCR酶預混液，其特征是還含有以下成分：

內標準基因RBE4的上游引物、下游引物、探針，序列分別是SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：3

外源基因克螟稻2號的上游引物、下游引物、探針，序列分別是SEQ?ID?NO：4～SEQ?ID?NO：6；

標準品，為含有不同濃度的克螟稻2號和RBE4基因片段的質粒分子標準物質，數量為3～8個。

2.權利要求1所述的試劑盒，還含有質控品，為含量1％和5％的轉基因水稻克螟稻2號種子粉末標準物質；且所述標準品的數量為4～6個。

3.權利要求2所述的試劑盒，所述標準品的數量為5個，克螟稻2號和RBE4基因片段的濃度分別為10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/ml。

4.一種轉基因水稻克螟稻2號核酸定量檢測方法，其特征為：

1)精確稱取質控品和待測樣品，所述質控品如權利要求1所述；

2)分別提取質控品和待測樣品的基因組DNA，所得DNA純度應為A₂₆₀1.8～2.0，且濃度大于20ng/μL；

3)分別將內標準基因RBE4的上游引物、下游引物、探針、外源基因克螟稻2號的上游引物、下游引物、探針用去離子水溶解配制成濃度為10μM的工作液；

4)將每個標準品、質控品DNA和待測樣品DNA分別進行熒光定量PCR擴增，所述標準品如權利要求1所述；

5)進行熒光定量PCR檢測，根據標準品的不同所示濃度和測得的Ct值繪制內標準基因和外源基因的標準曲線，通過該標準曲線對待測樣品進行定量。

5.權利要求4所述的檢測方法，所述熒光定量PCR擴增中所用的PCR反應體系如下：

RBE4的反應體系：PCR酶預混液12.5μl，上游引物(400nM)0.5μl，下游引物(400nM)0.5μl，探針(200nM)0.25μl，克螟稻2號基因組DNA?5μl，去離子水補足25μl體系；

克螟稻2號的反應體系：PCR酶預混液12.5μl，上游引物(400nM)1μl，下游引物(400nM)1μl，探針(200nM)0.5μl，克螟稻2號基因組DNA?5ul，去離子水補足25μl體系。

6.權利要求4所述的檢測方法，所述熒光定量PCR擴增中反應程序為：第一步94℃5分鐘；第二步45個循環94℃15秒，60℃60秒。

7.權利要求4所述的檢測方法，所述通過該標準曲線對待測樣品進行定量，是根據外源基因和內標準基因的標準曲線的方程分別計算外源基因和內標準基因的拷貝數，然后計算外源基因拷貝數/內標準基因拷貝數，再除以校正系數C得出定量檢測結果；所述校正系數C是22.7％。

8.RBE4在轉基因水稻克螟稻2號定量檢測中作為內標準基因的應用。

9.一種在轉基因生物定量檢測中修正檢測值與真實值偏差的方法，其步驟如下：

1)精確稱取轉基因生物與受體非轉基因生物樣品各一份；

2)分別提取轉基因生物與受體非轉基因生物基因組DNA，分別測定DNA濃度，

并分別測定所提取DNA的體積；

3)按照下列公式，分別計算轉基因生物與受體非轉基因生物的核酸提取效率E

4)按下列公式計算校正系數C：

C=E(transgene)E(receptor)]]>

式中，E(transgene)為轉基因生物核酸提取效率，E(receptor)為受體非轉基因生物核酸提取效率；

5)用轉基因成分的檢測值除以校正系數C，得到轉基因成分的含量。

10.權利要求9所述的方法，步驟1～步驟4重復進行多次，每次得到一個校正系數C；然后求出所有校正系數C的算術平均值；重復次數為5～10次。