[發(fā)明專利]一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210103880.6
• 申請日: 2012-04-11
• 公開（公告）號: CN102618620A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯曉鋒;史小娟
• 申請（專利權(quán)）人: 上海健耕醫(yī)藥科技有限公司;上海云澤生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá);謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于篩選藥物領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤基質(zhì)的前提，也是瘤細(xì)胞與基質(zhì)黏附以后發(fā)生的重大變化。金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡最重要的酶系。所以MMP是治療癌癥及腫瘤的重要靶點(diǎn)。但是現(xiàn)有體外的金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的篩選方法不能模擬MMP在體內(nèi)的作用方式，很多研究證明可溶性的MMP(比如：-1.-13，-2，-9)不能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1992年Gossen等成功地利用原核基因調(diào)控元件構(gòu)建了四環(huán)素(tetracycline，Tet)真核細(xì)胞基因調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，它利用Tet及其衍生物對所感興趣的基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。隨著人們對該系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，使這種誘導(dǎo)表達(dá)具有嚴(yán)密、高效、可控性強(qiáng)、表達(dá)泄露小等優(yōu)點(diǎn)。目前真核細(xì)胞可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究及基因治療研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，該方法建立了一個(gè)基于Retro-X?Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)的篩選MMP抑制劑的方法，該方法在體外最大程度模擬了MMP的作用環(huán)境，從而對候選藥物對MMP的作用做出更準(zhǔn)確的評估。

本發(fā)明的一種細(xì)胞水平篩選金屬基質(zhì)蛋白酶抑制劑的方法，包括：

(1)設(shè)計(jì)引物，PCR完成擴(kuò)增金屬基質(zhì)蛋白酶的全長cDNA；

(2)將上述擴(kuò)增的cDNA插入pRetroX-Tight-Pur的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建以Retro-X?Tet-Off為載體的表達(dá)體系；

(3)將上述構(gòu)建完成的載體對細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并篩選陽性克隆，當(dāng)細(xì)胞鋪滿皿底后，將培養(yǎng)基換成不含DOX的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)MMP的表達(dá)；

(4)設(shè)空白對照組、陽性對照組、陰性對照組和不同藥物濃度處理組，用細(xì)胞膜探針對細(xì)胞膜進(jìn)行染色觀察，利用對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的分析評估候選待評價(jià)藥物對MMP的作用。

所述步驟(1)中的引物為上游引物：TGAGGATCCATGCATCCAGGGTCCTGGC；下游引物：AGCTCGCGACTTAACACCACAAAATGG。

所述步驟(3)中的細(xì)胞系為PCS-100-011細(xì)胞系，人的大動(dòng)脈原代細(xì)胞，體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，可以形成一個(gè)類似與體內(nèi)細(xì)胞及基質(zhì)的環(huán)境。

所述步驟(4)中的細(xì)胞膜探針為DiI細(xì)胞膜探針，在熒光顯微鏡下可更方便的觀察分析。

本發(fā)明利用Retro-X?Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)在細(xì)胞表達(dá)，并發(fā)生作用，從而引起細(xì)胞形態(tài)變化，以細(xì)胞形態(tài)的變化作為篩選金屬基質(zhì)蛋白酶的標(biāo)志，培養(yǎng)過程中加入四環(huán)素抑制金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)，使細(xì)胞正常貼壁生長，呈正常的細(xì)胞形態(tài)。等細(xì)胞貼壁后，換成不含四環(huán)素的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶的表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化。細(xì)胞水平篩選抑制劑，細(xì)胞表達(dá)的蛋白酶的作用方式更加接近體內(nèi)。

有益效果

本發(fā)明建立了一個(gè)基于Retro-X?Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)的，能最大程度模擬MMP在體內(nèi)的作用的方法，可用于MMP抑制劑的篩選，能對蛋白酶抑制劑有更準(zhǔn)確的判斷，細(xì)胞形態(tài)作為篩選標(biāo)志更為直觀和靈敏，利用細(xì)胞膜熒光探針，使檢測更為方便快速，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

實(shí)施例以MMP-13為例，但是本專利不僅限于MMP-13，也可用于其他金屬基質(zhì)蛋白酶。本實(shí)施例采用Clontech公司Retro-X?Tet-Off?Advanced?Inducible?Expression?System，包含：pRetroX?Tet-Off質(zhì)粒，pRetroX-Tight-Pur質(zhì)粒以及pRetroX-Tight-Pur-luc對照質(zhì)粒。采用GP293細(xì)胞為包裝細(xì)胞。采用PCS-100-011作為靶細(xì)胞。

(1)MMP-13表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：