[發(fā)明專利]截短的細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白重組畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210103719.9
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102732436A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈萬忠;婁忠子;閆鴻斌;李宏民;倪興維
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組酵母的發(fā)酵工藝，確切講本發(fā)明涉及一種截短的細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白的tEG95重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法。?

背景技術(shù)

棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病(Hydatid?disease)，是對人畜危害極為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲疾病。該病呈世界性分布，我國是包蟲病發(fā)病最高的國家之一。在我國以囊型包蟲病(cystic?echinococcosis，CE)為主。CE對人畜危害極為嚴(yán)重，人可因誤食蟲卵感染該病，在肝、肺等器官形成占位性病灶。各種動物(包括人)都可因囊泡破裂而產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)而突然死亡。該病可導(dǎo)致我國畜牧業(yè)每年直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30多億元，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國流行區(qū)農(nóng)、牧民身體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，是“健康中國2020行動計劃”規(guī)劃防治的五大寄生蟲病之一。由于對中間宿主接種疫苗可控制包蟲病的流行，因此通過免疫預(yù)防途徑控制和消滅包蟲病是一項有效的措施和較為理想的途徑。?

研究證實，棘球絳蟲六鉤蚴分泌抗原具有較好的保護(hù)作用，但無法使其在體外培養(yǎng)中大量增殖，抗原來源量有限，限制了其在免疫預(yù)防中的廣泛應(yīng)用。如何找到一種可大量增殖棘球絳蟲六鉤蚴分泌抗原是現(xiàn)階段的要解決的問題。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供對重組的細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白進(jìn)行高效表達(dá)的高密度發(fā)酵方法以大量增殖并獲得棘球絳蟲六鉤蚴分泌抗原，特別是一種對截短的細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白的tEG95重組畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵方法。?

本發(fā)明上述內(nèi)容是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：挑取1個重組酵母工程菌單克隆EG95-1到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為5.0左右，得到一級種子培養(yǎng)液；再將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液濃度OD₆₀₀達(dá)到40.0左右，得到發(fā)酵工作種子液，上述培養(yǎng)過程均在28℃下進(jìn)行。本發(fā)明所使用的重組酵母工程菌單克隆EG95-1菌株系發(fā)明人構(gòu)建并鑒定，并于2012年02?月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No5764(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC?No5764，分類命名：巴斯德赤畢酵母(Pichia?pastoris)。?

本發(fā)明的截短的細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白(tEG95)重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法是將由前述的將發(fā)酵工作種子液按1∶10的體積比轉(zhuǎn)接于2000mL?BSM液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基pH到5.5開始增菌，增菌過程補(bǔ)加含50％(W/V)甘油和1.2％(V/V)PTM1的水溶液的補(bǔ)料1溶液，待菌液OD₆₀₀達(dá)到90.0左右，即重組酵母菌濕重達(dá)到140mg/mL左右，停加補(bǔ)料1溶液并繼續(xù)培養(yǎng)至耗盡甘油(，此時菌液OD₆₀₀約為72.00，濕重約為150mg/mL)，再在培養(yǎng)體系中分階段加入含1.2％(V/V)PTM1的甲醇溶液的補(bǔ)料2溶液進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，第一階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為10mL/h，補(bǔ)加3h，停加補(bǔ)料2約1h，至誘導(dǎo)后4h；第二階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為15mL/h，補(bǔ)加5h，停加2h，至誘導(dǎo)后11h；第三階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為20mL/h，補(bǔ)加10h，停加3h，至誘導(dǎo)后24h；第四階段的補(bǔ)加流速為25mL/h，補(bǔ)加72h，至誘導(dǎo)后96h，整個發(fā)酵過程的溫度均為28℃。?

相關(guān)研究表明，EG95蛋白具有良好的免疫保護(hù)作用，可以通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)。在現(xiàn)有的真核表達(dá)系統(tǒng)中，畢赤酵母表達(dá)體系具有幾大優(yōu)勢，包括可以在高細(xì)胞密度發(fā)酵罐培養(yǎng)基培養(yǎng)，蛋白表達(dá)成本低，蛋白表達(dá)量高，蛋白可以分泌表達(dá)，表達(dá)蛋白純度高，也易于純化，并且可以使外源蛋白在發(fā)酵罐中的表達(dá)水平比普通搖瓶提高10～100倍，完全可以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。我們的相關(guān)發(fā)明中首次在酵母表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)對EG95蛋白進(jìn)行了分泌表達(dá)。本發(fā)明主要提供一種對表達(dá)EG95目的蛋白的重組畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵的工藝，這為細(xì)粒棘球蚴EG95基因工程疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和最終應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。?

本發(fā)明中所用的重組畢赤酵母為重組了細(xì)粒棘球絳蟲EG95蛋白基因的畢赤酵母。經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明為首次用重組畢赤酵母菌在發(fā)酵罐內(nèi)對細(xì)粒棘球絳蟲EG95蛋白進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。本發(fā)明的蛋白表達(dá)過程具有操作簡單，蛋白表達(dá)成本低，蛋白可溶性表達(dá)，蛋白表達(dá)量高的優(yōu)點。其目的蛋白在發(fā)酵上清液中的濃度高達(dá)4.62g/L。?

附圖說明