[發(fā)明專利]一種大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210103262.1
• 申請(qǐng)日: 2012-04-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102634469A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付康
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 生工生物工程（上海）有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20
• 代理公司: 上海脫穎律師事務(wù)所 31259
• 代理人: 李強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞的狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)化效率最直接、關(guān)鍵的因素之一。通常有兩種方法獲得感受態(tài)細(xì)胞，一種是購(gòu)于商業(yè)公司，這種感受態(tài)通常有較高的轉(zhuǎn)化效率，每微克質(zhì)粒DNA產(chǎn)生10⁸個(gè)轉(zhuǎn)化克隆的轉(zhuǎn)化效率，但價(jià)格比較昂貴。另一種方法是實(shí)驗(yàn)室自己制備，目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl₂和Inoue法。CaCl₂法簡(jiǎn)便易行，但制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較低；Inoue法雖然感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率較高，但細(xì)菌的培養(yǎng)條件是18℃，振蕩19-50小時(shí)，搖菌的時(shí)間較長(zhǎng)，并且過(guò)程相對(duì)繁瑣。因而，研究一種轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)單實(shí)用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法，對(duì)于分子生物學(xué)的研究尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，它是一種轉(zhuǎn)化效率高、方便快捷、重復(fù)性好的感受態(tài)細(xì)胞制備方法。

本發(fā)明的大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，為將常規(guī)液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌，在大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度下(一般為37℃)振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.4-0.5左右，然后轉(zhuǎn)入17-19℃，振蕩培養(yǎng)0.9-1.1小時(shí)，再離心收集菌體后，采用氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞。具體的，本發(fā)明的大腸桿菌高效感受態(tài)細(xì)胞的制備方法包括下列步驟：

1)從LB平板上挑選新活化的大腸桿菌單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

2)將步驟1獲得的菌懸液接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，在大腸桿菌的最適生長(zhǎng)溫度下(一般為37℃)振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4-0.5左右；

3)將步驟2獲得的菌懸液轉(zhuǎn)入17-19℃，振蕩培養(yǎng)0.9-1.1小時(shí)；

4)將步驟3獲得的菌懸液加入無(wú)菌離心管中，冰浴后，冷凍離心收集菌體，棄上清，保留細(xì)胞沉淀；

5)用無(wú)菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重懸步驟4離心分離的菌體后冰浴；

6)將步驟5獲得的重懸液冷凍離心再次收集菌體，棄上清，保留細(xì)胞沉淀；

7)再用無(wú)菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重懸步驟6離心分離的菌體，即得感受態(tài)細(xì)胞。

步驟1中，長(zhǎng)有新活化的大腸桿菌單菌落的LB平板可采用常規(guī)方法獲得，如將大腸桿菌貯存菌液在無(wú)抗生素的LB平板上劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)獲得。

步驟1-3中，大腸桿菌振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速可采用常規(guī)，如200-250rpm。

步驟4-5中，冰浴的時(shí)間一般為8-12分鐘。

步驟4-5中，冷凍離心收集菌體的條件可采用常規(guī)，如溫度為3-5℃，離心力2950-3050g，離心時(shí)間4-6分鐘。

步驟5和7所用的CaCl₂水溶液的濃度及添加量，均可與常規(guī)氯化鈣法一致。

較佳的，步驟5中，CaCl₂水溶液與步驟4所取菌懸液的體積比為1∶(9-11)。步驟7中，CaCl₂水溶液與步驟4所取菌懸液的體積比為1∶(48-52)。

較佳的，步驟4所述的無(wú)菌離心管、步驟5和7所述的CaCl₂水溶液均經(jīng)預(yù)冷。

進(jìn)一步的，在步驟7之后，可加入無(wú)菌甘油，使甘油最終含量達(dá)到15-20％(體積百分比)，分裝凍存感受態(tài)細(xì)胞。

本發(fā)明的有益效果是：該方法轉(zhuǎn)化率高，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，能滿足常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，是一項(xiàng)較為實(shí)用的新技術(shù)，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式：

以下列舉實(shí)施例以進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制專利的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化效率測(cè)定

本實(shí)施例中所用的材料和試劑如下：

材料：受體菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；pUC19來(lái)自生工生物工程(上海)有限公司。

試劑：

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化鈉10克，蒸餾水定容至1升，PH7.0，121℃滅菌20分鐘。