[發明專利]一種大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法

無效

• 申請號: 201210103262.1
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102634469A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 付康
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 上海脫穎律師事務所 31259
• 代理人: 李強

1.大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，為將常規液體培養至對數生長期的大腸桿菌，在大腸桿菌的最適生長溫度下振蕩擴大培養至OD₆₀₀為0.4-0.5左右，然后轉入17-19℃，振蕩培養0.9-11小時，再離心收集菌體后，采用氯化鈣法制備感受態細胞。

2.如權利要求1所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，具體包括下列步驟：

1)從LB平板上挑選新活化的大腸桿菌單菌落接種于LB液體培養基中，在大腸桿菌的最適生長溫度下振蕩培養過夜；

2)將步驟1)獲得的菌懸液接種于新鮮的LB液體培養基中，在大腸桿菌的最適生長溫度下振蕩培養至OD₆₀₀為0.4-0.5左右；

3)將步驟2)獲得的菌懸液轉入17-19℃，振蕩培養0.9-1.1小時；

4)將步驟3)獲得的菌懸液加入無菌離心管中，冰浴后，冷凍離心收集菌體，棄上清，保留細胞沉淀；

5)用無菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重懸步驟4)離心分離的菌體后冰浴；

6)將步驟5)獲得的重懸液冷凍離心再次收集菌體，棄上清，保留細胞沉淀；

7)再用無菌的0.09-0.11MCaCl₂水溶液重懸步驟6)離心分離的菌體，即得感受態細胞。

3.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，步驟1)-3)中，大腸桿菌振蕩培養的轉速為200-250rpm。

4.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，步驟4)-5)中，冰浴的時間為8-12分鐘。

5.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，步驟4)-5)中，冷凍離心收集菌體的條件為3-5℃，離心力2950-3050g，離心時間4-6分鐘。

6.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，步驟5)中，CaCl₂水溶液與步驟4)所取菌懸液的體積比為1∶(9-11)。

7.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，步驟7)中，CaCl₂水溶液與步驟4)所取菌懸液的體積比為1∶(48-52)。

8.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，步驟4)所述的無菌離心管、步驟5)和7)所述的CaCl₂水溶液均經預冷。

9.如權利要求2所述大腸桿菌高效感受態細胞的制備方法，其特征在于，在步驟7)之后，加入無菌甘油，使甘油最終含量達到體積百分比為15-20％，分裝凍存感受態細胞。