[發(fā)明專利]基于高通量測序技術(shù)進(jìn)行核酸定性定量檢測的方法

有效

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• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102628082A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊楠;艾洪新;臧伯瑋;何越
• 申請（專利權(quán)）人: 凱晶生物科技(蘇州)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于高通量測序技術(shù)進(jìn)行核酸定性定量檢測的方法。

背景技術(shù)

高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序(Sanger測序)一次革命性的改變。傳統(tǒng)測序技術(shù)一次只能測單一的基因片段，在1990年-2003年首次完成的一個人的全基+因組測序使用的就是傳統(tǒng)的Sanger法，花費(fèi)了十幾年的時間，耗費(fèi)了巨大的資金，動員了多個國家的數(shù)百科學(xué)家。而高通量測序可一次對幾十萬到幾百萬條甚至幾千萬條DNA分子片段進(jìn)行序列測定，完成一個人的基因組測序目前達(dá)到只需要幾天的時間，成本降到幾千美元。

高通量測序一般稱為下一代測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)包括目前的Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和HiSeq技術(shù)、ABI公司的SOLiD技術(shù)、Life?technologies公司的Ion?torrent測序技術(shù)、Helicos?HeliscopeTM和Pacific?Biosciences推出的單分子測序技術(shù)，及將要出現(xiàn)的其它高通量測序技術(shù)。

高通量測序技術(shù)應(yīng)用前景很廣，已經(jīng)應(yīng)用到各物種基因組全測序、表觀基因組學(xué)、宏基因組學(xué)及功能基因組學(xué)研究的許多方面。雖然這些應(yīng)用極大地增加了發(fā)現(xiàn)與人類疾病息息相關(guān)的各種基因突變、短片段插入/缺失、基因組水平異常的機(jī)會，但目前還主要停留在研究階段，還沒有作為臨床診斷和檢測手段，更沒有對各種環(huán)境下的微生物種群及其比例關(guān)系進(jìn)行鑒定。造成這種現(xiàn)狀的主要原因一是現(xiàn)有高通量技術(shù)使用成本高，二是還沒有一種基于高通量測序的定性定量方法。

目前常用的核酸定性方法是做一個PCR擴(kuò)增，有產(chǎn)物產(chǎn)生就斷定是某種DNA。這種方法雖然簡單，但一次只能鑒定一種DNA；又由于PCR非常靈敏，極易被污染造成假陽性結(jié)果。研究核酸定量的方法目前是real-time?Q-PCR(熒光實(shí)時定量PCR)方法。所謂real-time?Q-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或者熒光探針，利用熒光信號產(chǎn)生時的擴(kuò)增循環(huán)位點(diǎn)(Ct值)與樣品中靶標(biāo)的量有對數(shù)關(guān)系，實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程中熒光信號的累積過程，最后通過與樣品中另一參照物或標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對的定量分析方法。因此，靶標(biāo)定量有兩種策略：相對定量和絕對定量。相對定量指的是在樣本中靶標(biāo)量相對于另一參照物的量。絕對定量指的是用已知量的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算靶標(biāo)的未知量。

在一份核酸混合物樣品中利用real-time?Q-PCR技術(shù)定量分析各成分，除每次主要只能分析一個成分外，無論是相對定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問題有待解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個必不可少的過程。目前由于無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各個實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性。此外，用real-time?Q-PCR來研究mRNA時，受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物(參照物)不受實(shí)驗(yàn)條件的影響，合理地選擇合適的不受實(shí)驗(yàn)條件影響的內(nèi)源控制物也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)證明要做到這一點(diǎn)是很難的。另外，與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，Real-time?Q-PCR的不足之處是：(1)由于運(yùn)用了封閉的檢測，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，因此也就不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小；(2)因?yàn)闊晒馑胤N類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制了real-time?Q-PCR的復(fù)合式(multiplex)檢測的應(yīng)用能力；(3)目前real-time?Q-PCR實(shí)驗(yàn)成本比較高，技術(shù)操作難度大，從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種基于高通量測序技術(shù)進(jìn)行核酸定性定量檢測的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中熒光實(shí)時定量PCR方法進(jìn)行核酸定性和定量檢測中的種種不足之處。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種基于高通量測序技術(shù)進(jìn)行核酸定性定量檢測的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

(1)將待捕獲的基因組隨機(jī)打斷后采用第一引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；所述第一引物一端與標(biāo)記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區(qū)域序列互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列；

(2)使用捕獲組分對進(jìn)行第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列進(jìn)行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴(kuò)增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合；