[發明專利]基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法

有效

• 申請號: 201210103138.5
• 申請日: 2012-04-10
• 公開（公告）號: CN102628082A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發明（設計）人: 楊楠;艾洪新;臧伯瑋;何越
• 申請（專利權）人: 凱晶生物科技(蘇州)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

1.?一種基于高通量測序技術進行核酸定性定量檢測的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：

（1）將待捕獲的目的基因組隨機打斷后采用第一引物進行第一次PCR擴增；所述第一引物一端與標記有生物素的第一接頭DNA片段相連，并與待捕獲的目的基因區域序列互補結合的寡核苷酸單鏈序列；?

（2）使用捕獲組分對進行第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列進行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結合的固相載體；所述親和素與所述第一次單向PCR擴增后的目的基因區域序列上的生物素相結合；

（3）使用第二引物對親和素結合后的目的基因區域序列進行第二次單向PCR擴增；所述第二引物一端與第二接頭DNA片段相連，并與所述目的基因區域序列互補結合，且與第一引物進行PCR擴增的方向相反；

（4）將第二次單向PCR擴增后的目的基因區域序列除去親和素生物素復合物，?獲得兩端帶有相同或不同DNA接頭的單鏈DNA文庫；

（5）采用高通量測序技術對獲得的單鏈DNA文庫進行測序，然后對測序結果進行核酸的定性分析和定量分析，獲得核酸定性定量檢測結果。

2.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相載體為微球。

3.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相載體為磁性微球。

4.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。

5.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一接頭DNA片段具有SEQ?No：1或3的連續核苷酸序列，且5’端通過生物素進行標記；第二接頭DNA片段具有SEQ?No：2或4的連續核苷酸序列。

6.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第一引物進行第一次PCR擴增的第一PCR反應體系包括PCR?緩沖液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區域序列作為模板DNA，所述第一PCR反應體系終濃度組成為：

PCR緩沖液?終濃度1～10?×；

dNTPs??0.01～1.5mM；

引物序列???終濃度為0.01～2μM；

模板DNA???0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶??0.01～1.0U/μL；

MgCl₂???終濃度為0.5～5mM。

7.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述第二引物進行第二次PCR擴增的第二PCR反應體系包括PCR?緩沖液、dNTPs、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、待捕獲的目的基因區域序列作為模板DNA，所述第二PCR反應體系終濃度組成為：

PCR緩沖液?終濃度1～10?×；

dNTPs??0.01～1.5mM；

引物序列???終濃度為0.01～2μM；

模板DNA???0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶??0.01～1.0U/μL；

MgCl₂???終濃度為0.5～5mM。

8.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟（1）中待捕獲的基因組是從選自人或動物或微生物群體中提取的。

9.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟（5）中高通量測序技術選自454焦磷酸測序方法、Illumina?Solexa?合成測序方法、ABI?SOLiD連接法測序方法、?Life?technologies?公司的Ion?torrent?測序方法、單分子測序方法。

10.?根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟（5）中進行核酸的定性分析和定量分析是利用計算機軟件計數和簡單的統計分析(t-test)、標準差分析方法來完成。