[發明專利]柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法

無效

• 申請號: 201210101160.6
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102605092A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 黃麗;唐科志;周常勇;李中安;蘇華楠
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所 50211
• 代理人: 郭云

技術領域

本發明屬于一種環介導等溫擴增(Loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)分子檢測方法，特別涉及一種柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法。

背景技術

柑橘黃龍病(Huanglongbing，HLB)是世界柑橘業最具毀滅性的病害之一，是國內外植物檢疫對象。該病害在我國主要由韌皮部桿菌屬細菌的亞洲種(Candidatus?Liberibacter?asiaticus)引起。特征性病狀是病樹的“黃梢”和葉片的斑駁型黃化；果實小，畸形，嚴重影響柑橘的品質與產量。目前由于缺乏有效藥劑和抗病品種，主要采取砍除病樹、防治木虱和種植無病苗木的的防治方法，因此加強柑橘黃龍病的早期診斷顯得尤為重要。由于傳統的指示植物診斷、電鏡檢測和免疫學檢測方法不僅費時費力，而且檢測效率低；近年來，聚合酶鏈式反應(PCR)已應用到柑橘黃龍病的檢測上，但是PCR檢測技術需要特殊儀器設備且檢測成本較高，不適合在田間大規模快速應用，因此，在加強柑橘苗木檢疫監測中，迫切需要一種成本低廉、簡便、快速、靈敏和特異的柑橘黃龍病快速檢測方法。

LAMP是由Notomi于2000年開發的一種新型的核酸擴增技術，該技術利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區域，借助具有鏈置換作用的Bst?DNA聚合酶，在等溫條件下進行靶序列高效擴增。它避免了常規PCR溫度循環的特殊要求，并且因其高效性、簡易性、成本低廉且檢測周期短等特點，又在另一層面上提高了它的應用價值。現已運用的領域主要集中在植物病毒和轉基因食品的檢驗檢疫工作中，在細菌、真菌、線蟲和昆蟲的檢驗檢疫工作相關報道相比甚少，因而有較大的開拓空間，LAMP檢測技術將會在植物檢疫領域發揮重要作用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有傳統檢測技術中的不足之處，提供一種靈敏度高、特異性強、不需要電泳及特殊儀器的柑橘黃龍病LAMP快速檢測方法，用于柑橘黃龍病的田間早期診斷。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：一種柑橘黃龍病的LAMP快速檢測方法，包括用于檢測柑橘黃龍病的LAMP擴增特異性引物組，分別為：

omp-FIP

5′-GCCATGATACGACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCCAAT-3′

omp-BIP

5′-CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCCTC?AGA-3′

omp-F3?5′-ATTCGGCGTGAACTTGAA-3′

omp-B3?5′-GCTATACCTACAGAACCAGC-3′。

本發明利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區域，借助具有鏈置換作用的Bst?DNA聚合酶，在等溫條件下進行靶序列高效擴增，建立了簡便、快速、靈敏度高和特異性強的HLB環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法，便于在田間大規模快速應用。

本發明的柑橘黃龍病LAMP檢測方法按照如下步驟完成：

(1)柑橘黃龍病病葉總DNA提取，采用CTAB法提取柑橘黃龍病DNA得到模板DNA溶液；

(2)柑橘黃龍病的LAMP擴增，配置反應體系為25μL，所述反應體系中各組分的含量為5×Reaction?Buffer、8mM?MgSO₄、1.2mM?dNTPs、Bst?DNA聚合酶8U、1.6μM?omp-FIP、1.6μM?omp-BIP、0.2μM?omp-F3、0.2μM?omp-B3、模板DNA?1.0μL，加ddH₂O補足25μL，混勻，于63℃水浴鍋中反應70min，之后80℃下滅活5min結束反應；所述5×Reaction?Buffer含100mM?Tris-HCl?pH?8.8、50mM?KCl、50mM(NH4)₂SO₄、0.5％Tween?20。

(3)反應結束后，觀察濁度，白色渾濁即為陽性，否則為陰性；或在反應液中加入SYBR?Green?I顯色液，出現綠色表明為陽性，橙色則表明為陰性；或瓊脂糖凝膠電泳，獲取電泳圖譜，圖譜中出現特征性梯狀條帶為陽性，未出現特征性梯狀條帶為陰性。

有益效果：本發明的LAMP檢測方法具特異性強、靈敏度高、簡便快速、成本低等優點，無需電泳及特殊儀器，便于在田間大規模應用，該方法為HLB病害監測構建了一個快速檢測的技術平臺。

說明書附圖