[發(fā)明專利]甜葉菊同源四倍體植株的培育方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210101031.7
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102613085A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 向增旭;李紅
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種植物新品種的培育方法，具體來說是涉及一種糖料作物甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域。

背景技術(shù)

甜葉菊(Stevia?rebaudiana?Bertoni)為雙子葉植物綱菊科斯臺維亞屬多年生草本植物，原產(chǎn)南美巴拉圭阿曼拜山脈，當?shù)鼐用癜阉鳛樘鸩栾嬘靡呀?jīng)有一百年的歷史，是一種新型的糖料作物。甜葉菊葉片中含有甜味成分甜菊糖苷，其甜度為蔗糖的250～300倍，且無毒、高甜度、低熱量、無副作用。甜葉菊具有較高的經(jīng)濟價值，于1976年在我國引種成功，近年來常規(guī)育種為甜葉菊品種改良做了較多試驗，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，為品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新又增加了新的可行方法。如果能在離體快繁條件下利用誘變劑秋水仙素對甜葉菊進行同源四倍體誘導(dǎo)，不僅可提高產(chǎn)量和質(zhì)量，同時還創(chuàng)新了種質(zhì)資源。

植物染色體組多倍化是植物進化的一個重要標志。由二倍體誘導(dǎo)形成的同源四倍體具有器官巨大性、活性成分含量提高、抗逆性增強、育性降低等顯著特征。自上世紀30年代開始，我國在多倍體育種方面獲得較大成功，如糧食作物小麥、黑麥、水稻；蔬菜作物蘿卜、番茄、不結(jié)球白菜、茄子等；果樹中的葡萄、獼猴桃、香蕉；藥用植物中的百合、黃芩、枸杞、桔梗、鐵皮石斛等；經(jīng)濟作物亞麻、甜菜、煙草、牧草等，多倍體的應(yīng)用非常廣泛。關(guān)于甜葉菊多倍體誘導(dǎo)方面的研究僅1995年陳紹潘利用實生苗點滴法獲得同源四倍體，易受外界影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有甜葉菊中甜菊糖苷含量低的問題，根據(jù)植物細胞染色體加倍后，其基因劑量倍增使植物的新陳代謝增強，染色體上基因調(diào)控的有效化學(xué)成分含量往往較二倍體高，同時多倍體植物具有器官巨大性的特征而提供一種甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，可短期內(nèi)培育出有效成分(甜菊糖苷)含量較高的甜葉菊同源四倍體植株，以滿足人們在食品和醫(yī)藥工業(yè)中對甜菊糖苷類甜味成分的需求。本發(fā)明以甜葉菊不定芽作為誘變材料，采用秋水仙素溶液與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的方法，進行多倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得較高的誘導(dǎo)率并在短期內(nèi)得到大量的四倍體組培苗。

本發(fā)明甜葉菊同源四倍體植株的培育方法通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

甜葉菊同源四倍體植株的培育方法，該方法利用濃度為0.5g/L～2.0g/L的秋水仙素溶液浸泡甜葉菊不定芽12～48h，用無菌水清洗后接種在MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～30天獲得變異幼苗，再將幼苗接種到生根培養(yǎng)基中，待根長至2～3cm。

上述方法具體包括以下步驟：將不定芽浸泡在加入2％二甲基亞砜的濃度為0.5g/L～2.0g/L秋水仙素溶液中，處理12～48h，浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3～4次，吸干水接種到MS培養(yǎng)基中，在光照度1500～2000Lx，每天光照12h，溫度23～25℃的環(huán)境條件下培養(yǎng)20～30天，得到長3～4cm變異幼苗，將幼苗接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，待根長至2～3cm。

該方法所述的生根培養(yǎng)基的組成為：

1/2MS培養(yǎng)基

不定芽的獲得包括以下步驟：選取甜葉菊植株的嫩芽，滅菌后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度23～25℃，每日光照12h，光照度1500～2000Lx，培養(yǎng)15～20天，誘導(dǎo)出不定芽。所述的滅菌方法是將甜葉菊植株的嫩芽先用洗衣粉洗凈，再用流動的清水沖洗1～2h，用75％酒精浸泡30S，無菌水沖洗2～3次之后放入0.10％的升汞溶液中浸泡5～8min，用無菌水沖洗3～4次。

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為：

MS培養(yǎng)基

本發(fā)明甜葉菊同源四倍體植株的培育方法具體包括以下步驟：

A、不定芽的獲得：取甜葉菊植株的嫩芽，先用洗衣粉洗凈再用流動的清水沖洗1～2h。用75％酒精浸泡30S，無菌水沖洗2～3次之后放入0.10％的升汞溶液中浸泡5～8min，用無菌水沖洗3～4次，將滅菌后的嫩芽接種到下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：

MS培養(yǎng)基

以日光燈為光源，光照度1500～2000Lx，每天光照12h，溫度(24±1)℃的環(huán)境條件下培養(yǎng)15～20天，誘導(dǎo)出不定芽。

B、甜葉菊同源四倍體誘導(dǎo)：將不定芽浸泡在濃度為0.5～2.0g/L秋水仙素溶液(加入2％二甲基亞砜)中，處理12～48h，浸泡后的不定芽用無菌水沖洗3～4次，吸干水接種到MS培養(yǎng)基中，在光照度1500～2000Lx，每天光照12h，溫度23～25℃的環(huán)境條件下培養(yǎng)20～30天，得到長3～4cm變異幼苗，將幼苗接種到以下生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)：