[發明專利]一種大黃歐文氏菌及其在制備低乳糖牛奶中的應用

無效

• 申請號: 201210101015.8
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102634468A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 夏雨
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23C9/152;C12R1/18
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

1.一種大黃歐文氏菌(Erwinia?rhapontici)E602株，該菌株已于2011年3月17日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏編號為CGMCC?No.4678。

2.一種利用根據權利要求1所述的大黃歐文氏菌E602生產低乳糖牛奶的方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A、制備一級種子

取大黃歐文氏菌E602菌株菌液劃線至含IPTG和X-Gal的營養瓊脂培養基，在培養箱中于溫度24-28℃下培養20-28h；從該營養瓊脂培養基表面挑取藍色有金屬光澤的大黃歐文氏菌E602株單菌落，轉移至4-6mL?LB液體培養基中，在溫度24-28℃與轉速180-220r/min的條件下培養10-14h，獲得一級種子；

B、制備二級種子

按照以TSA液體培養基體積計1-4％接種量，將步驟A)得到的一級種子接種至45-55mL?TSA液體培養基中，在溫度24-28℃與轉速180-220r/min的條件下培養12-18h，獲得二級種子；

C、發酵培養

按照以TSA液體培養基體積計1-4％接種量，將步驟B)得到的二級種子接種至4-6L?TSA液體培養基中，在溫度24-30℃、轉速180-220r/min與不通氣的條件下發酵12-20h，然后進行離心分離，收集含β-半乳糖苷酶的菌體；

D、分離β-半乳糖苷酶

收集在步驟C)得到的含β-半乳糖苷酶的菌體，在重懸于磷酸鹽緩沖液后，將得到的重懸液于冰浴中進行超聲波破碎，然后進行離心分離，收獲上清液，向所得上清液中添加硫酸銨粉末，在硫酸銨飽和度達到20-60％的溶液中進行硫酸銨鹽析，再進行離心分離，其沉淀物用磷酸鹽緩沖液重懸，接著透析除去硫酸銨，再進行離心分離，收獲上清液；所得上清液再進行陰離子交換色譜層析與凝膠色譜層析分離，于是得到純β-半乳糖苷酶；

E、制備低乳糖牛奶

向新鮮牛乳中加入在步驟D)得到的β-半乳糖苷酶，使牛乳中β-半乳糖苷酶的濃度達到2.0-30.0U/mL，然后在溫度0-40℃水浴中進行水解4-20h，得到一種低乳糖牛奶。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的超聲波破碎是在超聲波功率200-500w的條件下進行超聲處理500-700次。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在超聲波破碎后，所述的離心分離是在18000-22000r/min與溫度0-6℃的條件下進行離心20-40min。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在硫酸銨鹽析后，所述的離心分離是在8000-12000r/min與溫度0-6℃的條件下進行離心8-12min。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在如下的條件下進行離子交換色譜層析分離：DEAE?FF陰離子交換柱，流動相A為20mmol/L?Tri-HCl溶液，pH7.0-7.5；流動相B為20mmol/L?Tri-HCl和2mol/L?NaCl的溶液，pH7.0-7.5，上樣流速為2-5mL/min，洗脫流速為4-8mL/min，在波長280nm處測定紫外光吸收度。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在如下的條件下進行凝膠色譜層析分離：Sephacry?S-100凝膠柱，流動相為50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液和0-100.0mmol/L?NaCl的溶液，pH?7.0-7.5，上樣流速為0.4-2.0mL/min，洗脫流速為0.4-2.0mL/min，在波長280nm處測定紫外光吸收度。

8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在步驟D)得到的β-半乳糖苷酶在pH4.0-9.0范圍內具有良好的酶活性。