[發(fā)明專利]一種鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210100921.6
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN103361376A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡青海;于圣青;韓先干;丁鏟;仇旭升;宋翠萍;譚磊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/64
• 代理公司: 上海百一領(lǐng)御專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31243
• 代理人: 馬育麟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鴨疫里默氏桿菌是黃桿菌科里默氏桿菌屬的代表種。里默氏桿菌屬是新獨立出來的一個屬，目前對鴨疫里默氏桿菌質(zhì)粒的研究還僅限于檢測和序列測定。比如Chang?等對從臺灣分離的鴨疫里默氏桿菌菌株研究后表明，60%（36/60）菌株中攜帶一種3.9?kb大小的質(zhì)粒；12%?(7/60)菌株中攜帶?6.5?kb?和?16?kb兩種質(zhì)粒；?5%?(3/60)菌株中攜帶2.9kb,?16kb?和?18?kb三種質(zhì)粒，另外13%菌株中無質(zhì)粒。并在?GenBank上發(fā)表了3.9?kb?質(zhì)粒?pCFC1的全序列。?Weng?S等發(fā)表了一個5.?6?kb大小的質(zhì)粒pCFC2的全序列。Chen等測定了鴨疫里默氏桿菌兩種新質(zhì)粒pRA0726和pRA0846的全序列。這兩種質(zhì)粒的同源性高的，pRA0846只比pRA0726少一個bla_OXA-209基因和一個321bp的ORF1。

穿梭質(zhì)粒是能在兩種或兩種以上宿主中復(fù)制的質(zhì)粒，鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體是指在大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌中均能自主復(fù)制和穩(wěn)定存在，且攜帶的外源基因能在鴨疫里默氏桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒。以大腸桿菌為宿主，具有有利于基于穿梭表達(dá)載體的重組質(zhì)粒構(gòu)建與篩選、便于重組質(zhì)粒的保存和操作等優(yōu)勢；然后將構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌，這樣重組質(zhì)粒可以在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定存在，重組質(zhì)粒中攜帶的外源基因也可以在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定表達(dá)。鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體可用于鴨疫里默氏桿菌突變株的互補菌株構(gòu)建，以及構(gòu)建重組鴨疫里默氏桿菌以研制同時預(yù)防不同血清型的鴨疫里默氏桿菌感染或預(yù)防多種鴨傳染病的多聯(lián)疫苗。到目前為止，尚沒有鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體的報道及相關(guān)專利公布。

發(fā)明內(nèi)容???

本發(fā)明的目的是提供一種鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體能使外源基因在此載體相關(guān)元件的控制下，在鴨疫里默氏桿菌中實現(xiàn)表達(dá)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

?一種鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:1。

?本發(fā)明的另一方面，所述穿梭表達(dá)載體包括如下元件：鴨疫里默氏桿菌pRA0726質(zhì)粒的復(fù)制起始蛋白編碼序列、鴨疫里默氏桿菌ompA基因啟動子序列、大腸桿菌的復(fù)制起始序列、氨芐青霉素抗性基因、頭孢西丁抗性基因和多克隆位點。

?本發(fā)明的另一方面，其是以可在大腸桿菌工程菌中穩(wěn)定存在和復(fù)制的質(zhì)粒為骨架改造而來，所述質(zhì)粒選自pBR322、pUC19、pUC119或pCP29。本發(fā)明優(yōu)選質(zhì)粒pCP29為骨架進行改造。

本發(fā)明的另一方面，所述的鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭載體攜帶OriT序列，以利于構(gòu)建的穿梭表達(dá)載體通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式導(dǎo)入鴨疫里默氏桿菌中。

?本發(fā)明的另一方面，其含有使所述表達(dá)質(zhì)粒在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定存在的鴨疫里默氏桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起始元件和使攜帶的外源質(zhì)粒在鴨疫里默氏桿菌中表達(dá)的鴨疫里默氏桿菌基因的啟動子，以此使外源基因可在鴨疫里默氏桿菌中穩(wěn)定表達(dá)。

本發(fā)明的另一方面，所述鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭載體攜帶有抗性基因，以利于篩選重組質(zhì)粒和攜帶質(zhì)粒的重組細(xì)菌，所述穿梭表達(dá)載體中的頭孢西丁抗性基因可替換為紅霉素抗性基因或/和壯觀霉素抗性基因；氨芐青霉素抗性基因可替換為氯霉素或/和卡那霉素抗性基因。

本發(fā)明的另一方面，所述穿梭表達(dá)載體中用于表達(dá)外源基因的鴨疫里默氏桿菌OmpA蛋白啟動子序列可替換為鴨疫里默氏桿菌其他基因的啟動子序列。

本發(fā)明的另一實施方式，一種所述的鴨疫里默氏桿菌－大腸桿菌穿梭表達(dá)載體在重組鴨疫里默氏桿菌中的應(yīng)用，其用于抗多血清型的鴨疫里默氏桿菌病、抗鴨疫里默氏桿菌病和鴨病毒性肝炎以及鴨傳染病性疾病的聯(lián)合、多價重組疫苗，或者構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌突變株的互補菌株。

本發(fā)明的另一實施方式，一種穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法的步驟如下：