[發(fā)明專利]乳腺特異表達(dá)人殺菌通透性增強(qiáng)蛋白載體構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210100640.0
• 申請(qǐng)日: 2012-04-07
• 公開（公告）號(hào): CN102676581A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張運(yùn)海;章孝榮;桂濤;李運(yùn)生;劉亞;陳建文;章美玲;張宇;劉星;方富貴;丁建平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66
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• 代理人: 暫無(wú)信息

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種乳腺特異表達(dá)人殺菌通透性增強(qiáng)蛋白載體構(gòu)建方法，該方法用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器。

[背景技術(shù)]

人殺菌通/透性增強(qiáng)蛋白(hBPI)是由Weiss等人于1978年首次從人中性粒細(xì)胞(PMN)的嗜苯胺藍(lán)顆粒中分離得到，hBPI基因全長(zhǎng)編碼區(qū)包含1464個(gè)堿基對(duì)，翻譯后由456個(gè)氨基酸殘基組成分子量大小為55～60KD左右的蛋白，其結(jié)構(gòu)與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白類似，它能與游離的LPS或革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜膜LPS結(jié)合，結(jié)合所形成的BPI-LPS復(fù)合物能阻止LPS所引發(fā)的宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，起到中和內(nèi)毒素和殺滅細(xì)菌作用。人的PMNs(polymorphonuclear?neutrophils)中諸多抗菌成分中，BPI是唯一既能夠?qū)Ω锾m氏陰性菌發(fā)揮殺菌作用又可以中和內(nèi)毒素作用的抗菌肽類物質(zhì)，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真核細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用，此外，BPI還有促進(jìn)補(bǔ)體活化、增強(qiáng)吞噬調(diào)理作用，抑制血管生成、抑制炎性介質(zhì)釋放、減輕內(nèi)毒素血癥和防止休克發(fā)生等生物學(xué)作用，被稱為“超級(jí)抗生素”。因其本身為人體抗菌成分，不會(huì)引起機(jī)體免疫反應(yīng)，因此BPI在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。

天然的BPI不僅來(lái)源有限，而且提取方法復(fù)雜、獲得量低、價(jià)格昂貴，由于人們對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系認(rèn)識(shí)的局限，人工化學(xué)合成的BPI蛋白多為線性或含有簡(jiǎn)單二級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽，不能夠很好的模擬殺菌和抗內(nèi)毒素功能，BPI分子由于其抗菌活性，特別是抗革蘭陰性菌活性，大腸桿菌不適宜作為其表達(dá)的宿主菌，因此其表達(dá)研究一直以真核細(xì)胞、酵母等真核表達(dá)為主，真核表達(dá)雖然具有活性高的優(yōu)點(diǎn)，但產(chǎn)量較低、表達(dá)周期長(zhǎng)、成本高。目前重組BPI及其衍生物在應(yīng)用上存在著活性不高、半衰期短、用藥劑量大，嚴(yán)重影響其臨床應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因乳腺生物反應(yīng)器是指通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因?qū)雱?dòng)物基因組并在乳腺特異表達(dá)重組蛋白，動(dòng)物乳腺作為一個(gè)專門化的外分泌腺體，其天然高效合成、分泌蛋白的能力很強(qiáng)，可以對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行一系列加工修飾，因而動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白具有活性高、產(chǎn)量高、易于純化等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是生產(chǎn)重組藥用蛋白理想的“加工場(chǎng)”。

當(dāng)前，動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研制面臨的突出問(wèn)題是成功率不高、表達(dá)水平偏低，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，研制成本較高。基因構(gòu)件是制備動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器上游關(guān)鍵材料之一，直接影響目的基因的表達(dá)水平。

[發(fā)明內(nèi)容]

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種乳腺特異表達(dá)人殺菌通透性增強(qiáng)蛋白載體構(gòu)建方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，乳腺特異表達(dá)人殺菌通透性增強(qiáng)蛋白載體構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)計(jì)合成如下序列：XhoI酶切位點(diǎn)+Kozak序列+牛β-酪蛋白信號(hào)肽+人BPI的CDS序列+XhoI酶切位點(diǎn)，體外合成并克隆至pUC57載體的EcoR?V酶切位點(diǎn)處，命名為pUC57-hBPI；

(2)使用限制性內(nèi)切酶Sal?I分別酶切pUC57-hBPI、pBC1-loxp-neo-loxp-pBD；膠回收插入pUC57載體的體外合成的外源片段、pBC1-loxp-Neo-loxp片段；使用T4連接酶連接上述回收的片段；

(3)上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至氨芐抗性平板，挑單菌落搖菌；設(shè)計(jì)引物P1、P2、P3，使用菌液PCR法快速鑒定；

所述引物具體情況如下：

上游hBPI1：5’-ACCATGAAGGTCCTCATCCTT-3’，錨釘在插入序列的5’末端；

下游hBPI2：5’-ATAGACAACGTCTGCACCGAA-3’，錨釘在插入序列的3’末端；

上游hBPI3：5’-TCTTTGGTTCCTTTTAAAG-3’，錨釘在載體上XhoI插入位點(diǎn)上游骨架序列匹配；

下游hBPI4：5’-TCCATCACTGGTGGAGCAAA-3’，錨釘在插入序列的5’末端；

上游hBPI5：5’-CTTTGGTTCCTTTTAAAGGGAAG-3’，錨釘在載體上XhoI插入位點(diǎn)上游骨架序列匹配；

下游hBPI6：5’-TTTGTAGGGCTCTTAATTACTCA-3’，錨釘在載體上XhoI插入位點(diǎn)下游骨架序列匹配；

將引物hBPI1/hBPI2、hBPI3/hBPI4、hBPI5/hBPI6，菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆送基因測(cè)序，得到陽(yáng)性的克隆pBC1-loxp-Neo-loxp-hBPI。

本發(fā)明的有效果是：