[發(fā)明專利]一種HBD3 乳腺特異性表達(dá)載體及構(gòu)建的重組細(xì)胞

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210100590.6
• 申請(qǐng)日: 2012-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN102628061A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余源;張涌;王勇勝;劉軍;權(quán)富生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué);楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12N15/873
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，包含帶有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的HBD3基因，分別在HBD3基因的上游和下游設(shè)有CSN5和CSN3作為調(diào)控元件。

2.如權(quán)利要求1所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，所示的帶有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的HBD3基因的序列如SEQ.IC.NO.1所示；CSN5的序列如SEQ.ID.NO.2所示，CSN3的序列如SEQ.ID.NO.3所示。

3.如權(quán)利要求2所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的CSN3的下游還設(shè)有pUC?ori和attB序列。

4.如權(quán)利要求3所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的attB序列的下游還設(shè)有CMV組成型啟動(dòng)子，CMV組成型啟動(dòng)子下游插入兩個(gè)同向的LoxP元件，在LoxP元件下游設(shè)有第一熒光指示蛋白開放閱讀框及其終止子，在兩個(gè)LoxP元件之間設(shè)有第二熒光指示蛋白開放閱讀框及其終止子和抗生素篩選元件。

5.如權(quán)利要求4所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的attB序列如SEQ.ID.NO.4所示，所述的CMV組成型啟動(dòng)子為Pcmv?IE啟動(dòng)子。

6.如權(quán)利要求4所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，所述的第一熒光指示蛋白開放閱讀框?yàn)榫G色熒光蛋白EGFP開放閱讀框，第二熒光指示蛋白開放閱讀框?yàn)榧t色熒光蛋白DsRed1開放閱讀框，其終止子均為Sv40終止子。

7.如權(quán)利要求1或3所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，所述的HBD3乳腺特異性表達(dá)載體為pARNG-HBD3，將HBD3基因插入到pARNG載體的CSN5和CSN3之間。

8.一種重組牛胎兒成纖維細(xì)胞，其特征在于，宿主細(xì)胞為牛胎兒成纖維細(xì)胞，通過共轉(zhuǎn)染的方式將外源性表達(dá)載體pARNG-HBD3在鏈霉菌噬菌體φC31整合酶的作用下整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組假attP位點(diǎn)，通過藥物篩選取得陽性克隆，再經(jīng)過Cre重組酶的處理，去除載體上兩個(gè)同向LoxP序列之間的抗生素篩選標(biāo)記，得到去除抗生素篩選標(biāo)記的包含HBD3乳腺特異性表達(dá)載體的重組牛胎兒成纖維細(xì)胞。

9.如權(quán)利要求8所述的重組牛胎兒成纖維細(xì)胞，其特征在于，所述的pARNG-HBD3整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的第2號(hào)常染色體上，位于KIAA1486基因和IRS-1基因之間的間隔序列。

10.權(quán)利要求8或9所述的去除抗生素篩選標(biāo)記的包含HBD3乳腺特異性表達(dá)載體的重組牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞的應(yīng)用。