[發明專利]紫貽貝C型溶菌酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201210100101.7
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102643787A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 王春艷;母昌考;宋微微;李榮華;王春琳
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/56;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及溶菌酶，具體涉及紫貽貝C型溶菌酶及其制備方法。

背景技術

溶菌酶（Lysozyme，EC?3.2.1.17）是無脊椎動物體內非常重要的固有免疫因子之一，它主要通過切斷肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵之間的聯結，破壞肽聚糖支架，使細胞脹裂從而引起細菌裂解。溶菌酶在機體免疫應答過程中不僅能直接殺死細菌，還可誘導調節其他免疫因子的合成與分泌。溶菌酶按照其來源可分為六類：C（chicken）型、G（goose）型、I（invertebrate）型、植物型、細菌型和T4噬菌體型溶菌酶。G型溶菌酶主要存在于哺乳動物、鳥類和魚類中，專利號為CN?2004100506518及2004100506522?從扇貝中獲得了G型溶菌酶，而I型溶菌酶只存在于無脊椎動物中，C型溶菌酶大都來自于脊椎動物。由于C型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抑制和滅殺作用，在較低溫度條件下活性較高且具有較強的熱穩定性，因此在作為水產飼料添加劑和水產品保鮮劑方面具有很好的應用前景。目前，針對C?型溶菌酶已開展較多研究，發現其通常含有?130個左右的氨基酸殘基，具有4?對二硫鍵，三維結構呈較緊密的橢球。研究發現，Glu³⁵、Asp⁵²及Trp⁶²殘基是C型溶菌酶活性的必需氨基酸殘基，Asp¹⁰¹、Arg^ll4、Trp¹⁰⁸等殘基對“底物-酶復合物”的形成也發揮著重要作用?(Muraki?M，et?a1，1997)。近期研究發現，鮑魚、三疣梭子蟹等無脊椎動物也存在C型溶菌酶，并且該類型的C型溶菌酶具有較強的抑制革蘭氏陰性菌活性。迄今為止，尚未有關于紫貽貝C型溶菌酶及其抗菌活性的研究報道。

發明內容

本發明提供了紫貽貝C型溶菌酶及表達基因，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示，該紫貽貝C型溶菌酶對各種病原菌具有較好的抗菌作用。

本發明還提供了紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，該制備方法能得到純度較高的紫貽貝C型溶菌酶。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為紫貽貝C型溶菌酶，該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。表達該紫貽貝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示。

紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，其步驟如下：

1）總RNA提取：用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于-80℃備用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進行；

2）mRNA純化：用Oligotex?mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA；純化方法依據QIAGENE公司的Oligotex?mRNA純化試劑盒說明書進行；

3）cDNA模板制備：用cDNA?Synthesis?Kit試劑盒（購于Stratagene公司）將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說明書進行：包括雙鏈cDNA經末端補平、EcoR?I?接頭連接、EcoR?I末端磷酸化、Xho?I內切酶酶切等，用QIAEX?II?Agarose?Gel?Extraction?Kit純化試劑盒（購于QIAGEN公司）對大于100bp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP?XR?vector載體（購于Invetrogen公司）連接，得到cDNA質粒，用ZAP-cDNA?Gigapack?III?Gold?Cloning?Kit試劑盒（購于Stratagene公司）對cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%的二甲基亞砜（DMSO），得到含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；具體包裝、測定和擴增方法依試劑盒說明書進行；測序該C型溶菌酶表達基因的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示；