[發明專利]紫貽貝C型溶菌酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201210100101.7
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102643787A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 王春艷;母昌考;宋微微;李榮華;王春琳
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C12N15/56;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

1.紫貽貝C型溶菌酶，其特征在于該紫貽貝C型溶菌酶的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。

2.權利要求1所述的紫貽貝C型溶菌酶，其特征在于表達所述的紫貽貝C型溶菌酶的C型溶菌酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示。

3.權利要求1所述的紫貽貝C型溶菌酶的制備方法，其特征在于其步驟如下：

1）紫貽貝總RNA的提取：用Trizol試劑從鰻弧菌感染的紫貽貝血淋巴中提取總RNA，存于-80?℃備用；?

2）紫貽貝mRNA純化：用Oligotex?mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA；

3）紫貽貝cDNA模板制備：用cDNA?Synthesis?Kit試劑盒將上述mRNA逆轉錄并酶切為酶切片段，用QIAEX?II?Agarose?Gel?Extraction?Kit純化試劑盒對大于100?bp的酶切片段進行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP?XR?vector載體連接，得到cDNA質粒，用ZAP-cDNA?Gigapack?III?Gold?Cloning?Kit試劑盒對cDNA質粒進行噬菌體包裝、滴度測定、噬菌體文庫擴增，擴增后的噬菌體文庫加入體積百分終濃度為7%?的二甲基亞砜，得到含核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.2所示的C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；

4）基因克隆：對上述含C型溶菌酶基因的cDNA模板溶液進行PCR擴增，PCR擴增的引物如下：正向引物序列TTACTTGTCT?TGGTACTTGT?G，反向引物序列TTTGTATGCT?ATTTTATTTT?G，3’端PCR擴增的反應體系和反應條件為：10?×?PCR?buffer?2.5?μl、25?mM的MgCl₂?溶液1.0?μl、2.5?mM的dNTP溶液?2.0?μl、10?μM?的上述正向引物溶液1?μl、10?μM?的通用引物T7溶液1?μl、濃度為5?U/μl的Taq?DNA聚合酶0.2?μl，所述cDNA?模板溶液1?μl，用PCR?水定容到25?μl，反應條件為94℃預變性5分鐘，然后進入下列循環：94℃變性45秒，60?℃退火30秒，72℃延伸60秒，共進行35個循環，最后72℃延伸10分鐘；5’端PCR擴增反應體系和反應條件為：10?×?PCR反應緩沖液2.5?μl、25?mM的MgCl₂?溶液1.0?μl、2.5?mM的dNTP溶液2.0?μl、10μM?的上述反向引物溶液1?μl、10μM的通用引物T3溶液1?μl、濃度為5?U/μl的Taq?DNA?聚合酶0.2?μl，所述cDNA?模板溶液1?μl，用PCR?水定容到25?μl，反應條件為94℃?預變性5?分鐘，然后進入下列循環：94℃變性?45?秒，60?℃?退火30?秒，72℃延伸60秒，共進行35個循環，最后72℃延伸10分鐘；PCR產物經膠回收試劑盒純化，與pMD18-T載體連接得到克隆質粒，轉入大腸桿菌TOP10F感受態細胞中，挑選陽性克隆提取質粒，得到C型溶菌酶基因的克隆質粒；?

5）表達質粒構建：以上述C型溶菌酶基因的克隆質粒為模板進行PCR擴增反應，擴增反應的正向引物為含有Nco?I酶切位點的核苷酸序列：?CCATGGCTAC?AAAAACGAAG?TGCCA，反向引物為含Xho?I酶切位點和6個His純化標簽的核苷酸序列：CTCGAGTTAG?TGGTGGTGGT?GGTGGTGACA?TGTGCTGTAA?TCGT；將擴增片段純化回收，導入pMD18-T載體，構建亞克隆質粒，轉入大腸桿菌TOP10F感受態細胞中，篩選陽性亞克隆質粒，提取陽性亞克隆質粒，用Nco?I和Xho?I雙酶切亞克隆質粒；用膠回收純化試劑盒對酶切產生的目的片段純化回收，并將該片段導入經同樣雙酶切的表達載體pET-21a?(+)中，構建得到C型溶菌酶的表達質粒；

6）表達質粒表達：將上述表達質粒轉入表達宿主菌BL21?(DE3)?plysS，篩選陽性克隆并經測序確認，將陽性克隆接種于LB培養基中，220rpm，37℃培養至OD₆₀₀=0.5-0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其終濃度達到0.6?mM，繼續培養5?h，然后8000rpm離心10分鐘收集菌體；

7）蛋白純化：對上述菌液超聲破碎、離心獲得包涵體，并對包涵體進行洗滌和溶解，然后采用鎳柱親和層析純化，最后對純化產物進行透析、復性得到氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示的紫貽貝C型溶菌酶。