[發明專利]改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法

無效

• 申請號: 201210100046.1
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102604888A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 邢向輝;王小競;張陶濤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責任公司 61108
• 代理人: 邱志賢

1.改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取嚙齒類動物下頜切牙根尖端唇側頸環組織并消化：酶混合液中消化組織塊；酶消化液是濃度為0.1%?dispaseⅡ蛋白酶及濃度為0.1%Ⅰ型膠原酶混合液，消化溫度為37度，消化時間為15-20min；

2）接種：消化液離心后收集組織塊并接種于培養板；

3）純化：去除成纖維細胞，獲得純化的頸環上皮細胞。

2.根據權利要求1所述的改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，其特征在于，步驟2）所述接種步驟為：

a.?含組織塊消化液離心，離心溫度為室溫，離心速度為1000-1200r/min,離心時間為2-3min?；

b.?于六孔板滴加培養液使恰好覆蓋組織塊即可，顯微器械均勻分離組織塊于培養板培養液中；

c.?蓋上蓋玻片，蓋玻片體積為24x24mm,?滴加培養基至2.5ml。

3.根據權利要求2所述的改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，其特征在于，所述培養液為含體積百分比為10%胎牛血清的DMEM-F12培養基。

4.根據權利要求2所述的改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，其特征在于，所述六孔板為一次性塑料培養板更有利于放置組織塊，即表面涂布多聚賴氨酸，以利于上皮細胞的貼壁。

5.根據權利要求1所述的改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，其特征在于，步驟3）所述純化步驟為：

a．胰酶在37度的條件下，預熱10min;

b．棄舊培養基，無血清DMEM-F12培養基清洗細胞2次以去除殘余血清；

c．加入胰酶，胰酶量為完全覆蓋細胞，高度2-3mm，胰酶消化1-2min；

d．顯微鏡下觀察梭形成纖維細胞收縮，聚集生長的上皮細胞無明顯變化時,棄胰酶，含血清培養基終止消化，槍頭吹吸去除成纖維細胞，添加新的完全培養基繼續培養；

e．1-2次胰酶消化后，即可得到純化的上皮細胞。

6.根據權利要求5所述的改良組織塊法培養嚙齒類動物切牙頸環上皮細胞的方法，其特征在于，所述胰酶為含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液。