[發(fā)明專利]改良組織塊法培養(yǎng)嚙齒類動物切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210100046.1
• 申請日: 2012-04-09
• 公開（公告）號: CN102604888A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邢向輝;王小競;張?zhí)諠?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責(zé)任公司 61108
• 代理人: 邱志賢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種改良組織塊法培養(yǎng)嚙齒類動物切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

?牙外傷，齲病，牙周病，遺傳病均可導(dǎo)致牙齒缺失，直接影響患者的咀嚼功能及美觀，給患者的心理造成負(fù)面影響。目前牙齒修復(fù)的方法主要依賴于剩余牙齒及牙周組織，在不同程度上給健康牙齒及牙周造成損害。再生牙齒生物相容性好且不損壞鄰牙及牙周組織，因此牙齒再生成為近年研究熱點(diǎn)。嚙齒類動物切牙由于根尖端頸環(huán)干細(xì)胞龕的形成，可以終生不斷生長，常作為牙齒再生研究的動物模型。頸環(huán)干細(xì)胞龕為三層上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，內(nèi)釉上皮緊鄰牙乳頭，外釉上皮緊鄰牙囊，中間為星網(wǎng)狀層細(xì)胞。分離培養(yǎng)頸環(huán)上皮細(xì)胞能為牙齒再生及牙齒發(fā)育分子機(jī)制研究提供細(xì)胞模型。目前頸環(huán)上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法主要是酶消化法，該法耗時長，不利于保持細(xì)胞活性，可分次收集細(xì)胞解決這一問題，使步驟顯得繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種改良組織塊法培養(yǎng)嚙齒類動物切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞的方法，它能使原代細(xì)胞培養(yǎng)時酶消化時間縮短，節(jié)約時間，既有利于細(xì)胞自組織塊爬出，也不會對細(xì)胞造成損傷。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：提供一種改良組織塊法培養(yǎng)嚙齒類動物切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取嚙齒類動物下頜切牙根尖端唇側(cè)頸環(huán)組織并消化：酶混合液中消化組織塊；酶消化液是濃度為0.1%?dispaseⅡ蛋白酶及濃度為0.1%Ⅰ型膠原酶混合液，消化溫度為37度，消化時間為15-20min；

2）接種：消化液離心后收集組織塊并接種于培養(yǎng)板；

3）純化：去除成纖維細(xì)胞，獲得純化的頸環(huán)上皮細(xì)胞。

上述步驟2）所述接種步驟為：

a.?含組織塊消化液離心，離心溫度為室溫，離心速度為1000-1200r/min,離心時間為2-3min?；

b.?于六孔板滴加培養(yǎng)液使恰好覆蓋組織塊即可，顯微器械均勻分離組織塊于培養(yǎng)板培養(yǎng)液中；

c.?蓋上蓋玻片，蓋玻片體積為24x24mm,?滴加培養(yǎng)基至2.5ml。

所述培養(yǎng)液為含體積百分比為10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基。

所述六孔板為一次性塑料培養(yǎng)板更有利于放置組織塊，即表面涂布多聚賴氨酸，以利于上皮細(xì)胞的貼壁。

上述步驟3）所述純化步驟為：

a．胰酶在37度的條件下，預(yù)熱10min;

b．棄舊培養(yǎng)基，無血清DMEM-F12培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次以去除殘余血清；

c．加入胰酶，胰酶量為完全覆蓋細(xì)胞，高度2-3mm，胰酶消化1-2min；

d．顯微鏡下觀察梭形成纖維細(xì)胞收縮，聚集生長的上皮細(xì)胞無明顯變化時,棄胰酶，含血清培養(yǎng)基終止消化，槍頭吹吸去除成纖維細(xì)胞，添加新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

e．1-2次胰酶消化后，即可得到純化的上皮細(xì)胞。

所述胰酶為含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液。?

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明原代細(xì)胞培養(yǎng)時酶消化溫度為37度，消化時間縮短，節(jié)約時間，既有利于細(xì)胞自組織塊爬出，也不會對細(xì)胞造成損傷，兼具酶消化法及組織塊法的優(yōu)點(diǎn)；用培養(yǎng)板接種，覆蓋蓋玻片更又有利于組織塊貼壁；所用胰酶為含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液，胰酶37度預(yù)熱10min及使用EDTA均可以提高消化效率，縮短消化時間，減少對細(xì)胞的損傷。

附圖說明

下面結(jié)合實(shí)施例附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明：

圖1：原代培養(yǎng)5—7天組織塊周圍可見細(xì)胞爬出，上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞混雜；200?x；

?圖2：經(jīng)胰酶差別消化后純化的上皮細(xì)胞；400?x；

?圖3：頸環(huán)上皮細(xì)胞角蛋白染色陽性；400?x。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做一說明，以使本領(lǐng)域的研究人員可以更好的利用本技術(shù)進(jìn)行頸環(huán)上皮細(xì)胞培養(yǎng)，但所舉實(shí)施例不作為對本發(fā)明的限定。實(shí)驗(yàn)中操作均在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。

1）小鼠切牙頸環(huán)上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)

a.選取出生后5-7天小鼠，75%酒精中浸泡2-3秒，持針器及組織鑷脫頸處死小鼠，提取下頜骨，置于無菌PBS中。

b.待所有下頜骨提取完成后，維納斯剪及系結(jié)鑷分離下頜切牙，根尖端圓形膨大即為頸環(huán)，剪取根尖端唇側(cè)頸環(huán)組織，置于2ml濃度為?0.1%?I型膠原酶和濃度為0.1%?dispaseⅡ蛋白酶混合液中，消化溫度為37度。