[發明專利]堿性磷酸酶標記抗體的方法

有效

• 申請號: 201210099617.4
• 申請日: 2012-04-06
• 公開（公告）號: CN102645531A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 李子樵;王志文
• 申請（專利權）人: 上海藍怡科技有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 何新平

[技術領域]

本發明屬于生物醫藥技術領域，特別涉及一種堿性磷酸酶標記抗體的方法。

[背景技術]

隨著酶聯免疫檢測技術的發展，尋求一種簡捷高效的酶標記抗體技術越來越重要。堿性磷酸酶(簡稱AP)作為一種免疫診斷試劑應用廣泛的酶，將其偶聯至抗體上，是診斷試劑開發中至關重要的一步。將標記抗體的方法基本上分為兩類。一類用雙功能基團的化合物使酶與抗體隨機偶聯，如戊二醛一步法。由于酶分子上游離氨基極少，而抗體分子上氨基則相對較多，為了彌補這一缺陷，往往采用8-12個酶分子與1個抗體分子的比值進行調整。戊二醛二步法的原理，主要是AP的氨基極少，而加入的戊二醛分子數相對較多，當戊二醛中的一個醛基與酶分子上的一個氨基結合后，則余下的一個醛基再與另一酶分子上的氨基作用的可能性極少，故很少產生酶與酶間的偶聯。當除去未作用的戊二醛后，己醛化的酶與抗體作用而成為結合物，但這一方法標記效果也并不理想。另一類用過碘酸鈉氧化酶分子中的含糖部分使酶本身產生多個醛基，酶的活性中心未受影響或影響不大，而醛化了的酶再與待標記的抗體作用即可獲得結合物。這一方法由Nakane等首創，其特點是標記效果高而所得的結合物分子量較大。上述方法除標記效果較差的戊二醛一步法外，操作均較為復雜。

本發明結合以上標記方法，對酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時間進行了優化，對操作過程中涉及到的透析繁瑣操作進行了方法改進，簡化了操作，縮短了時間。在此基礎上實現了進一步提高標記效果，操作簡便，穩定的堿性磷酸酶標記抗體的方法。

[發明內容]

本發明為了克服現有技術的不足，提供了一種標記效果好、操作簡單的堿性磷酸酶標記抗體的方法。

為了實現上述目的，本發明設計了一種堿性磷酸酶標記抗體的方法，采用如下步驟：

A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0.5ml濃度為0.05M，PH值為3.6-6.6的NaAc溶液中，使堿性磷酸酶的濃度為3-10mg/ml；

B)向步驟A中的酶溶液內加入等體積的過碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進行氧化，氧化時間為20min；

C)向氧化后的酶溶液內，加入與步驟A所得溶液等體積的乙二醇-NaCl溶液；

D)向步驟C中的溶液內，加入含量為1.5ml的冰冷無水乙醇，混勻，并在室溫為-20℃的條件下靜置1小時，4000g離心10min，得到氧化好的酶；

E)用含量為0.5ml濃度為0.05M，pH值為8-10的碳酸鹽緩沖液溶解沉淀步驟D中得到的酶，并加戊二醛0.1ml，混勻；

F)按質量比，酶∶抗體的比例范圍為1∶1至1∶4的比例，加入待標記的抗體溶液進行反應，反應時間為1-3小時；

G)按質量比，NaBH4∶酶的比例范圍為0.1∶1至0.2∶1的比例，加入NaBH4溶液，室溫放置1-3小時；

H)加入0.6ml的冰冷無水乙醇，并在-20℃的室溫下靜置1小時，4000g離心10分鐘；

I)按所需酶標抗體濃度用PBS溶解或凍干保存。

所述乙二醇-NaCl溶液的配方為NaCl，乙二醇和水。

所述的NaCl的含量為22g，乙二醇的含量為2.3ml，水的含量100ml。

所述待標記的抗體溶液為HbcAb的PBS溶液。

本發明同現有技術相比，對酶氧化的試劑，緩沖液，氧化時間進行了優化，對操作過程中涉及到的透析繁瑣操作進行了方法改進，簡化了操作，縮短了時間。從而進一步提高了標記效果。

[附圖說明]

圖1為本發明實施例一中表1的線形圖。

圖2為本發明實施例二中表2的線形圖。

圖3為本發明實施例三中表3的線形圖。

圖4為本發明實施例四中表4的線形圖。

[具體實施方式]

下面結合實施例對本發明作進一步描述。

實施例一：

A)將5mg堿性磷酸酶溶解在含量為0.5ml濃度為0.05M，PH值為5.6的NaAc溶液中。

B)向步驟A中的酶溶液內加入0.5ml濃度為0.06M過碘酸鈉溶液，并在室溫為4攝氏度的條件下進行氧化，氧化時間為20min。

C)向氧化后的酶溶液內，加入0.5ml乙二醇-NaCl溶液。乙二醇-NaCl溶液的配方為，稱取22g?NaCl，加2.3ml乙二醇，再加水至100ml制得該溶液，室溫可長期保存。