[發明專利]一種高收率人凝血酶原復合物的制備方法

有效

• 申請號: 201210098844.5
• 申請日: 2012-04-06
• 公開（公告）號: CN102614219A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 岳躍飛;單永紅;資道鳳;黃忠文
• 申請（專利權）人: 湖南紫光古漢南岳制藥有限公司
• 主分類號: A61K35/16
• 分類號: A61K35/16;A61K38/54;A61K38/48;A61K38/45;A61K38/36;A61K47/18;A61P7/04;C12N9/74;C12N9/12;C07K14/745
• 代理公司: 衡陽市科航專利事務所 43101
• 代理人: 劉勛階

技術領域

本發明屬于生物制藥領域藥物制備方法，特別是一種高收率人凝血酶原復合物的制備方法。

背景技術

對乙型血友病和因肝臟疾患引起的凝血功能異常，目前主要采用高純度人凝血因子Ⅸ，或是主要含有維生素K依賴的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的凝血因子復合物（凝血酶原復合物）血漿蛋白制劑。輸注人凝血酶原復合物能提高血液中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的濃度，主要用于治療先天性和獲得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏癥。

現有的人凝血酶原復合物的生產方法，均采用去除冷沉淀的上清新鮮血漿或FⅢ沉淀為原料，包括以下工序：DEAE?sephadex?A-50凝膠吸附、洗滌、洗脫、超濾、S/D病毒滅活、凝膠吸附、洗滌、洗脫、超濾、除菌分裝、凍干、干熱滅活。如華蘭生物公開的《凍干人凝血酶原復合物的生產方法》（公開號：CN?1475569A），江西博雅公開的《一種人凝血酶原復合物的制備工藝》（公開號：CN?101974070A），山東泰邦公開的《提高人凝血酶原復合物穩定性FⅦ得率的工藝方法》。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的上述不足,而提供一種工藝簡單、安全性高、產品收率高、比活高的高收率人凝血酶原復合物的制備方法。

本發明的技術方案是：一種高收率人凝血酶原復合物的制備方法，包括化漿、調整蛋白濃度和pH值、凝膠吸附、洗滌、洗脫、稀釋調整蛋白濃度和離子強度、S/D病毒滅活、再凝膠吸附、再洗滌、洗脫、超濾、除菌分裝、凍干、干熱滅活工藝步驟，調整蛋白濃度和pH值時，將去除冷沉淀、澄清過濾的血漿用2-8℃0.9%生理鹽水調整蛋白濃度至3.0-5.0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調pH值至6.8-7.2。

本發明進一步的技術方案是：稀釋調整蛋白濃度和離子強度后，再加入0.5-1.5%的甘氨酸保護劑。

洗滌、洗脫時，洗滌液中氯化鈉濃度為0.10-0.15mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02?mol/L，pH值為6.8-7.2；洗脫液中氯化鈉濃度為1.5-2.0mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02?mol/L，pH值為6.8-7.2。

再洗滌、洗脫時，洗滌液中氯化鈉濃度為0.02-0.05mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02?mol/L，pH值為6.8-7.2；洗脫液中氯化鈉濃度為1.5-2.0mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02?mol/L，pH值為6.8-7.2。

除菌分裝時，檢測濃縮液效價，依據檢測結果先加入0.5-1.5%的甘氨酸和0.5-1.5%鹽酸精氨酸，再加入肝素鈉。

本發明與現有技術相比，具有工藝簡單、安全性高、產品收率高、比活高等特點，產品收率達到45.28±2.26萬IU?(以IX因子效價計算)/噸血漿，比活達到0.87±0.12IU/mg：

本發明在DEAE?sephadex??A-50凝膠吸附前，用2-8℃0.9%的生理鹽水調整蛋白濃度至3.0-5.0%，然后用醋酸-醋酸鈉緩沖液調整pH值至6.8-7.2，利用血漿中各組分蛋白等電點的差異，使凝血酶原Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子充分被DEAE?sephadex?A-50凝膠吸附，而其他蛋白盡可能不吸附或少吸附。試驗結果表明，本發明與現有工藝比較，以Ⅸ因子為例，產品得率提高15-20%，比活由原來的0.62±0.26IU/mg提高到0.87±0.12IU/mg。

本發明在洗滌、洗脫時，先用氯化鈉濃度為0.050-0.075mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02?mol/L，pH值為6.8-7.2的洗滌液洗滌，再用氯化鈉濃度為1.5-2.0mol/L，枸櫞酸鈉濃度為0.01-0.02?mol/L，pH值為6.8-7.2的洗脫液洗脫，通過控制洗滌液和洗脫液的氯化鈉、枸櫞酸鈉濃度以及pH值，達到既能有效去除雜蛋白，又能盡可能多的保留有效成分Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的活性，明顯提高這類相關因子的回收率。以Ⅸ因子為例，試驗結果表明，本發明此步操作回收率可以達到91.87%±2.56%，經進一步處理后，所得制品的總回收率達到72%以上，比現有工藝提高了15-20%。

本發明在S/D病毒滅活前，先將洗脫液用0.45-1.0um的濾芯過濾除去細小顆粒，然后用0-8℃注射用水將洗脫液稀釋至蛋白濃度為0.5-2.5%，離子強度為5-15ms/cm，加入0.5-1.5%的甘氨酸保護劑，最后加入S/D溶液，由于降低了蛋白濃度，加入了蛋白保護劑，既保證了S/D病毒滅活效果，在操作過程中又能使有效成分Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ因子的活性損失更少。