[發(fā)明專利]一種獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210097484.7
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102612965A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盛春玲;高江云;林華;范旭麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園
• 主分類號: A01G1/00
• 分類號: A01G1/00;A01G31/00;A01H4/00
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53108
• 代理人: 謝嘉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獲得蘭科植物種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，具體來說涉及一種利用硬葉蘭(Cymbidium?bicolor)原生地收集的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質(zhì)等作為培養(yǎng)基質(zhì)，在實驗室培養(yǎng)誘導(dǎo)種子萌發(fā)，獲得原球莖，再從原球莖中分離、培養(yǎng)和篩選出種子萌發(fā)有效共生真菌的方法。

背景技術(shù)

蘭科植物的種子非常細小，僅有發(fā)育不完全的胚，在自然條件下種子萌發(fā)需要依靠特定的共生真菌來獲取營養(yǎng)物質(zhì)。目前蘭科植物種子的萌發(fā)，多采用人工培養(yǎng)基在無菌條件下進行非共生萌發(fā)，萌發(fā)率雖高，但在進行瀕危種類野外回歸時，幼苗移植到自然環(huán)境中存活率較低，并且由于無法與自然界中的真菌建立共生關(guān)系從而導(dǎo)致后續(xù)生長嚴重受限。通過種子和其有效萌發(fā)真菌在自然條件下的共生萌發(fā)能很好的解決這一問題。有效真菌的獲得目前多采用從蘭科植物野生植株的根中分離，但由于蘭科植物根中存在著大量作用未知的內(nèi)生真菌，這使得種子萌發(fā)有效真菌的篩選和分離變得復(fù)雜而繁瑣，同時，不同蘭科植物根中的真菌與種子萌發(fā)階段的有效共生真菌是否相同目前仍不確定。因此，獲得種子萌發(fā)的有效共生真菌是開展珍稀瀕危蘭科植物回歸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，為實現(xiàn)硬葉蘭的野外回歸創(chuàng)造條件。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

除非另有說明，本發(fā)明所采用的百分數(shù)均為重量百分數(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案主要是基于以下認識：

我們收集硬葉蘭原生地植株周圍的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質(zhì)等作為培養(yǎng)基質(zhì)，和硬葉蘭的種子在實驗室進行遷地共生萌發(fā)，誘導(dǎo)種子萌發(fā)產(chǎn)生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌后在無菌條件下用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導(dǎo)原球莖中的內(nèi)生真菌生長，待長出菌絲時，進行真菌的純化，獲得純菌落，并進行真菌的分子鑒定和保存。將獲得的真菌和硬葉蘭的種子進行共生萌發(fā)培養(yǎng)，設(shè)置對照實驗，以檢驗所獲得的真菌對硬葉蘭的種子萌發(fā)的有效性，結(jié)果表明所獲得的真菌是硬葉蘭種子萌發(fā)的有效共生真菌，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

一種獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，包括以下的步驟：

(1)在硬葉蘭花期進行人工異交授粉，果實成熟但果莢尚未裂開時收獲果實，將種子干燥后用無菌的密閉玻璃容器置于-20℃條件下保存，待用；

(2)收集硬葉蘭成年植株根部20cm范圍內(nèi)的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質(zhì)制成培養(yǎng)基質(zhì)，分裝在培養(yǎng)皿中，在基質(zhì)上放置一層無菌尼龍網(wǎng)布，用無菌蒸餾水使培養(yǎng)基質(zhì)的水分達到飽和，每個培養(yǎng)皿中再放置10塊無菌尼龍網(wǎng)片，在每個尼龍網(wǎng)片上均勻播撒硬葉蘭種子，將播種好的培養(yǎng)皿放入人工氣候箱內(nèi)進行培養(yǎng)；

(3)在培養(yǎng)過程中，每周進行觀測，記錄種子的萌發(fā)情況，當(dāng)觀測到有種子萌發(fā)時，記錄每一階段種子或原球莖的數(shù)量，培養(yǎng)30～40天后獲得原球莖；

(4)將獲得的原球莖依次用自來水沖洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗后切成兩半，切口面貼于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA上進行培養(yǎng)；

(5)原球莖切口處長出菌絲時，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移3～5次后，得到純菌落；

(6)將消毒后的硬葉蘭種子放入無菌水中制成均勻的懸浮液，在滅菌后的燕麥瓊脂培養(yǎng)基表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養(yǎng)基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，同時設(shè)置不接菌的對照處理組，每個處理10個重復(fù)，用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養(yǎng)；

(7)每周觀察1次不同處理的種子，記錄種子萌發(fā)數(shù)量及萌發(fā)時間，并對種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況進行分級，記錄每一階段內(nèi)種子或原球莖的數(shù)量，通過和不接菌處理組的對比，篩選出硬葉蘭種子萌發(fā)的有效共生真菌。

所述的無菌尼龍網(wǎng)布孔徑為45μm。

上述步驟中，步驟(1)所述的種子干燥并保存前，用75％的酒精對果莢表面進行消毒3～5分鐘后，用無菌水清洗3～4次后用無菌刀片切開果實取出種子。

步驟(2)所述的收集的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質(zhì)等，放在陰涼處自然風(fēng)干后，用家用攪碎機加入無菌蒸餾水充分攪碎，混合均勻后作為培養(yǎng)基；所述的培養(yǎng)條件為：光照強度為2000Lx-3000Lx，溫度25℃±2℃，光周期12h/12h?L/D。

步驟(3)所述的在培養(yǎng)過程中，確保每個培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基質(zhì)保持濕潤，但處于水分不飽和的狀態(tài)。