[發(fā)明專利]一種獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210097484.7
• 申請(qǐng)日: 2012-04-05
• 公開（公告）號(hào): CN102612965A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛春玲;高江云;林華;范旭麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園
• 主分類號(hào): A01G1/00
• 分類號(hào): A01G1/00;A01G31/00;A01H4/00
• 代理公司: 昆明協(xié)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53108
• 代理人: 謝嘉

1.一種獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，包括以下的步驟：

(1)在硬葉蘭花期進(jìn)行人工異交授粉，果實(shí)成熟但果莢尚未裂開時(shí)收獲果實(shí)，將種子干燥后用無菌的密閉玻璃容器置于-20℃條件下保存，待用；

(2)收集硬葉蘭成年植株根部20cm范圍內(nèi)的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質(zhì)制成培養(yǎng)基質(zhì)，分裝在培養(yǎng)皿中，在基質(zhì)上放置一層無菌尼龍網(wǎng)布，用無菌蒸餾水使培養(yǎng)基質(zhì)的水分達(dá)到飽和，每個(gè)培養(yǎng)皿中再放置10塊無菌尼龍網(wǎng)片，在每個(gè)尼龍網(wǎng)片上均勻播撒硬葉蘭種子，將播種好的培養(yǎng)皿放入人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；

(3)在培養(yǎng)過程中，每周進(jìn)行觀測(cè)，記錄種子的萌發(fā)情況，當(dāng)觀測(cè)到有種子萌發(fā)時(shí)，記錄每一階段種子或原球莖的數(shù)量，培養(yǎng)30～40天后獲得原球莖；

(4)將獲得的原球莖依次用自來水沖洗，次氯酸鈉溶液消毒，無菌水漂洗后切成兩半，切口面貼于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基PDA上進(jìn)行培養(yǎng)；

(5)原球莖切口處長(zhǎng)出菌絲時(shí)，用無菌接種針不斷地挑取真菌菌落邊緣處的菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)移3～5次后，得到純菌落；

(6)將消毒后的硬葉蘭種子放入無菌水中制成均勻的懸浮液，在滅菌后的燕麥瓊脂培養(yǎng)基表面放置兩張無菌濾紙，分別吸取150微升的種子懸浮液均勻地散布在兩張濾紙條上；在培養(yǎng)基中心接種含有不同來源的單一共生真菌純培養(yǎng)物的瓊脂塊，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照處理組，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，用封口膜密封后置于人工氣候箱中培養(yǎng)；

(7)每周觀察1次不同處理的種子，記錄種子萌發(fā)數(shù)量及萌發(fā)時(shí)間，并對(duì)種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育情況進(jìn)行分級(jí)，記錄每一階段內(nèi)種子或原球莖的數(shù)量，通過和不接菌處理組的對(duì)比，篩選出硬葉蘭種子萌發(fā)的有效共生真菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于：所述的無菌尼龍網(wǎng)布孔徑為45μm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于：步驟(2)所述的培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為2000Lx-3000Lx，溫度25℃±2℃，光周期12h/12h?L/D。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于：步驟(4)所述的次氯酸鈉溶液有效氯離子濃度為1％，消毒3～5分鐘，無菌水沖洗3～4次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得硬葉蘭種子萌發(fā)有效共生真菌的方法，其特征在于：步驟(6)所述的培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度為2000Lx-3000Lx，溫度25℃±2℃，光周期12h/12h?L/D。