[發(fā)明專利]一種高純度納豆激酶的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210097463.5
• 申請(qǐng)日: 2012-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102604917A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范銘琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 范銘琦
• 主分類號(hào): C12N9/56
• 分類號(hào): C12N9/56;C12R1/125
• 代理公司: 上海三方專利事務(wù)所 31127
• 代理人: 吳干權(quán)

[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及食品工程中有關(guān)采用液體純種發(fā)酵生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種高純度納豆激酶的制備法。?

[背景技術(shù)]

納豆激酶是一種由納豆枯草桿菌產(chǎn)生的蛋白酶。最早從日本的傳統(tǒng)食品納豆中鑒別發(fā)現(xiàn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶具有降解血栓的功能，而且口服有效，長(zhǎng)期使用能降低中風(fēng)、血管梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，可作為一種功能性的保健食品，在世界各地均有銷售。傳統(tǒng)的納豆激酶制備方法是制備納豆后直接干燥粉碎，灌入膠囊后獲得。但由于其含大豆成分如嘌呤和維生素K2，嘌呤長(zhǎng)期服用可引起痛風(fēng)，維生素K2有凝血作用，與納豆激酶的溶血栓功能相反。本專利描述了一種采用細(xì)菌純種培養(yǎng)、液體深層發(fā)酵，再用柱層析法精制以制備高純度納豆激酶的方法。?

國(guó)內(nèi)申請(qǐng)02116667.6中描述了一種利用枯草芽孢桿菌制備納豆激酶的方法，其采用了枯草芽孢桿菌，而枯草芽孢桿菌包括了大量種類；不同的菌種其制備方法、培養(yǎng)特征也不同，但是在該申請(qǐng)中無(wú)法概括出明確的對(duì)于不同菌種的制備方法，該申請(qǐng)中所用的高濃度乙醇和硫酸銨沉淀納豆激酶和使用干燥粉碎的方法，無(wú)法很好的保留納豆激酶的天然活性，收率低，并且分離過(guò)程中的有機(jī)溶劑和高濃度硫酸銨對(duì)環(huán)境污染和人體具有危害。另外，該申請(qǐng)所述的目的產(chǎn)物純度不明，雖然描述產(chǎn)物分子量為27730道爾頓，但沒(méi)有表述蛋白質(zhì)序列，同時(shí)沒(méi)有直接描述其對(duì)纖維蛋白(血栓形成的主要物質(zhì)之一)的纖溶活性；?其中所述的目的產(chǎn)物的pI值為8.6，但是常規(guī)的納豆激酶蛋白質(zhì)序列計(jì)算的pI值為6.3，先前專利中沒(méi)有說(shuō)明該原因，綜上所述，該申請(qǐng)所制備的產(chǎn)物是否為納豆激酶是不清晰的。?

國(guó)內(nèi)申請(qǐng)200610168056是采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備異源性的重組納豆激酶，所產(chǎn)生的納豆激酶為包涵體，須用其他轉(zhuǎn)基因手段得到可溶性蛋白，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，最終產(chǎn)物為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，是否能直接用于人體還不清楚；同時(shí)該專利也描述了使用大量硫酸銨的蛋白質(zhì)沉淀法，這會(huì)降低收率并對(duì)納豆激酶的活性產(chǎn)生不利影響。?

[發(fā)明內(nèi)容]

本發(fā)明的目的是去除現(xiàn)有市場(chǎng)上粗制納豆激酶產(chǎn)品中含有的，從納豆中帶入的嘌呤和維生素K₂等雜質(zhì)，能更好地實(shí)現(xiàn)納豆激酶本身對(duì)心血管疾病的保護(hù)作用。?

為實(shí)現(xiàn)上述目的設(shè)計(jì)一種高純度納豆激酶的制備法，其特征在于由以下工藝步驟組成：?

a、采用細(xì)菌劃線或涂布分離出單一的納豆枯草桿菌，并在固體和液體培養(yǎng)基上進(jìn)行純種培養(yǎng)，所述的固體培養(yǎng)基質(zhì)量濃度為蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖3.5g/L、氯化鈉10g/L、瓊脂15g/L，pH?7.0；所述的液體培養(yǎng)基質(zhì)量濃度為：大豆蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、牛肉膏5g/L、氯化鈉2g/L，pH?7.0，培養(yǎng)溫度為35-42℃，?

b、采用液體深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行納豆枯草桿菌的發(fā)酵，發(fā)酵溫度為38～42℃；發(fā)酵時(shí)間為30-72hr，并通過(guò)震蕩、攪拌或通氣的方法供氧，?

c、發(fā)酵后通過(guò)離心或過(guò)濾的方法去除菌體，獲得澄清的含納豆激酶的培養(yǎng)?液，?

d、上述培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)柱層析的方法去除其他雜質(zhì)，納豆激酶從層析柱上洗脫，再經(jīng)濃縮、干燥，然后用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，產(chǎn)物呈一28kDa的條帶，用纖維平板檢測(cè)可見(jiàn)清晰的纖維溶解圈。?

步驟(a)納豆枯草桿菌培養(yǎng)溫度最優(yōu)為37℃。?

步驟(b)納豆枯草桿菌發(fā)酵溫度最優(yōu)為42℃。?

納豆枯草桿菌發(fā)酵時(shí)間最優(yōu)為48hr或51hr。?

柱層析方法為疏水層析或離子交換層析或先疏水層析再離子交換層析。?

所述的疏水層析采用疏水性樹(shù)脂。?

所述的疏水性樹(shù)脂是Phenyl瓊脂糖凝膠或Butyl瓊脂糖凝膠。?

所述的離子交換層析采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。?

所述的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為CM瓊脂糖凝膠或SP瓊脂糖凝膠。?

所述的洗脫采用氯化鈉溶液梯度洗脫。?

本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：?

(1)菌種的選擇及分離方法更好；菌種單純，安全性更好，所分離得到的納豆枯草桿菌(又名枯草納豆桿菌(Bacillus?subtilis?natto)是從食品納豆或用于制備納豆的微生物中純化而來(lái)，是納豆枯草芽孢桿菌，對(duì)人體無(wú)害；?

(2)培養(yǎng)方法不同，選擇了更合適的溫度和配方，在42度時(shí)，能夠得到更多的納豆激酶。?