[發明專利]一種高純度提取土壤微生物總DNA的方法

無效

• 申請號: 201210096840.3
• 申請日: 2012-04-05
• 公開（公告）號: CN102643797A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 于翠;胡興明;鄧文;葉楚華;熊超;彭波;李勇
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生態學技術領域，具體涉及一種桑園土壤微生物總DNA的提取方法。

背景技術

長期以來，有關土壤微生物的多樣性研究是通過分離培養來實現的。然而，絕大多數微生物種群尚不能實現純培養，這成為土壤微生物多樣性研究的一個限制性因素。隨著土壤微生物群落結構研究的不斷深入，借助現代分子生物學技術的研究方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-DGGE等避免了傳統研究方法不能全面獲取土壤微生物多樣性信息的缺陷，可以通過土壤微生物DNA表現出的多樣性，真實地反映土壤微生物種群結構情況，而土壤微生物群落基因組總DNA的高效、高品質提取，是從分子生物學水平對土壤微生物群落結構進行研究的前提條件。由于土壤理化成分復雜，常含有腐殖酸、酚類化合物、重金屬離子等影響DNA分子操作的物質，土壤樣品處理和實驗條件較復雜，耗時長，以致從土壤環境中獲得高純度微生物基因組DNA具有一定難度，DNA提取技術創新因此備受關注。目前已經報道了多種土壤微生物總DNA提取方法。從土壤提取微生物總DNA的方法大致分為兩類：直接提取法和間接提取法。間接法提取的DNA純度高，但其缺點是得到的細菌只占總菌群的25％～50％，而直接法提取的DNA超過細菌總DNA的60％。直接法由于能夠提取到較全的細菌DNA、省力、DNA產量高，因而發展很快。Tsai等使用SDS和溶菌酶裂解細胞提取總DNA，Tiedje等使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)去除腐殖酸，效果很好，Bourrain等人采用該方法從活性污泥中提取了DNA，Reddy等人從堆肥中提取了DNA。

桑園土壤微生物的多樣性及生命活動與桑園土壤結構的形成和改良、土壤肥力演變、桑樹根部病害的發生、桑樹營養物質供給和植株生長發育等密切相關，但目前尚未見應用免培養法研究桑園土壤微生物多樣性的報道。

發明內容

本發明是基于建立桑樹根圍土壤微生物群落結構的分子生態學試驗技術體系，借鑒已有的土壤微生物總DNA的提取方法，提供一種高效的可直接用于PCR分析的桑園土壤微生物總DNA提取方法。

為實現上述目的，本發明公開了如下的技術方案：

一.材料選擇

供試土壤于2011年3月7日采自湖北省農業科學院經濟作物研究所生產桑園(東經114°19′，北緯30°29′，海拔29m)的桑樹根圍，桑樹品種為湖桑32號。采集土壤為黃粘土，采樣深度為5～10cm表土層，按5點法取樣，混勻后放入無菌袋中，4℃保存，24h內完成土壤微生物基因組總DNA的提取。

二.試劑選擇

本發明采用的主要試劑中：十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP?K30)、聚乙二醇8000(PEG8000)、脲、去離子甲酰胺均購自華美生物工程有限公司；溶菌酶、蛋白酶均購自Sigma公司；硝酸銀購自中國人民解放軍第九五零九工廠；λDNA/HindIII?digest?DNA?Marker、2000DL?DNA?Marker和Taq?HS均購自大連寶生物工程有限公司；16SrDNA通用引物由上海英駿生物工程有限公司合成；土壤提取試劑盒Soil?DNA?Kit(50)購自Omega公司。

三.土壤微生物總DNA直接裂解方法

方法一CTAB-蛋白酶-SDS-反復凍融法

取5g土樣，向其中加入13.5mL?DNA提取液I(Tris-HCl?100mmol/L，EDTA?100mmol/L，Na₃PO₄100mmol/L，NaCl?1.5mol/L，1％CTAB；pH?8.0)和少許石英砂，漩渦振蕩器振蕩3min；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混勻，37℃、230r/min搖床中溫育1h；加入1.5mL?10％SDS，65℃水浴1h；反復凍融3次，8500r/min離心10min；取上清液，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(體積比25∶24∶1)抽提，8500r/min離心10min；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24∶1)再次抽提，8500r/min離心10min，取上清液，備用。

方法二PVP預處理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反復凍融法